Локализованный мутагенез и белковая инженерия. Белковая инженерия Методы белковой инженерии рациональный дизайн
Методы генетической инженерии, в частности клонирование индивидуальных генов или их частей, а также секвенирование ДНК, позволили значительно усовершенствовать методологию мутагенеза, устранив основные недостатки классических способов индукции мутаций в геномах. Классический генетический анализ предполагает воздействие мутагенного фактора in vivo на целый геном, в результате чего в нем возникают случайные мутации, зачастую множественные, что сильно осложняет идентификацию мутантов. Выявление мутантных особей осуществляют по измененным фенотипическим признакам, а природу мутации можно определить после секвенирования ДНК. Современный локализованный мутагенез, по сути, предполагает обратные действия: вначале клонируют интересующий ген или его сегмент, определяют его структуру в ходе секвенирования, а потом in vitro вносят требуемые изменения в его состав. Последствия вызванной мутации определяют после введения мутантного гена в исходный организм.
Самый простой вариант локализованного мутагенеза состоит в обработке клонированного фрагмента ДНК одним из мутагенных факторов, однако результатом такого воздействия будут тоже случайные изменения в структуре фрагмента. Более надежные и чаще применяемые методы локализованного мутагенеза осуществляются без использования мутагенных факторов. Среди типов мутаций преобладают делеции, вставки и замены нуклеотидов.
Делеции. Эти типы мутаций при локализованном мутагенезе получают с помощью эндонуклеаз. Используют как рестриктирующие, так и неспецифические эндонуклеазы. Наиболее простой случай использования рестриктаз состоит в расщеплении какого-либо генома с помощью рестриктазы, вносящей несколько разрывов с образованием липких концов. Полученные фрагменты вновь замыкают в кольцо с помощью ДНК-лигазы, что может привес ти к образованию молекул, не содержащих один из сегментов ДНК. При таком подходе формируются протяженные делеции, и его используют, как правило, в предварительных экспериментах, чтобы определить функции относительно больших участков клонированной ДНК.
Небольшие делеции получают следующим образом. Клонированный фрагмент расщепляют в составе вектора в подходящем сайте с помощью рестриктазы (рис. 21.1). Образовавшуюся линейную молекулу обрабатывают экзонуклеазой III, которая гидролизует в составе ДНК одну цепь,
начиная с 3’-конца. В результате получается набор молекул с одноцепочечными 5’-хвостами разной протяженности. Эти хвосты гидролизуют нуклеазой S1, специфичной к одноцепочечной ДНК, и в ДНК формируются делеции. Можно также применять экзонуклеазу Bal 31, которая катализирует деградацию обеих цепей, начиная с концов линейных молекул ДНК. Ход нуклеотических реакций регулируют, варьируя время инкубации, температуру и концен трацию фермента, индуцируя образование делеций разной длины. Полученные делеционные варианты линейных ДНК часто перед циклизацией снабжают линкерами, чтобы в районе делеции присутствовали рестрикционные сайты. Существуют и другие модификации описанных методов.
Вставки (инсерции). Для получения инсерций клонированную ДНК расщепляют рестриктазой или неспецифической эндонуклеазой, а затем лигируют образующиеся фрагменты в присутствии сегмента, который хотят вставить в ДНК. Чаще всего в качестве таких сегментов используют синтезированные химическим путем полилинкеры (глава 20).
Инсерции, как и делеции, способны нарушить целостность гена или структуру его регуляторных областей, в результате чего будет синтезироваться дефектный белок (в случае протяженных делеций или сдвига рамки считывания, как правило, неактивный) либо будут наблюдаться изменения процесса транскрипции интересующего гена. Таким способом чаще получают регуляторные мутанты и конструируют экспрессируемые векторы (глава 20).
Точечные мутации . Эти мутации представляют собой замену нуклеотидов. Для их получения можно использовать несколько подходов: дезаминирование цитозина, включение аналогов нуклеотидов, неправильное включение нуклеотидов при репарации пробела и др.
Первый способ основан на том, что остатки цитозина в одноцепочечной ДНК можно дезаминировать с образованием урацила с помощью обработки ионами бисульфита. Одноцепочечные участки в ДНК получают обычно вблизи сайтов рестрикции, например, при действии экзонуклеазы III. После обработки бисульфитом одноцепочечные бреши застраивают с помощью ДНК-полимеразы и лигируют концы. В сайтах, где вместо цитидилата при дезаминировании образовался уридилат, комплементарное положение займет аденилат, а при репликации такой молекулы произойдет замена пары GС на пару AT.
Другой подход при индукции замен состоит в обработке клонированной ДНК какой-либо рестриктазой в присутствии бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарушения в структуру дуплекса. В результате образуется только однонитевый разрыв ДНК. В месте однонитевого разрыва создают небольшой пробел, а затем застраивают его в присутствии ДНК-полимеразы, dATP, dGTP, dCTP и N-4-гидроксицитозинтрифосфата вместо dTTP. Гидроксицитозинтрифосфат включается в цепь вместо тимидилата, но при репликации ДНК спаривается одинаково хорошо и с аденилатом, и с гуанилатом. В результате включения гуанилата после дополнительного раунда репликации в данном сайте произойдет замена АТ→GC (рис. 21.2). Поскольку в данном методе замена нуклеотидов осуществляется внутри
сайта рестрикции, появляется возможность легко различить векторы с исходной последовательностью и мутантные. Для этого достаточно обработать их используемой в эксперименте рестриктазой: мутантные молекулы не подвергнутся расщеплению.
Похожий метод основан на использовании только трех из четырех возможных нуклеотидов при заполнении однонитевой бреши ДНК-полимеразой. В большинстве случаев фермент останавливается в том месте молекулы, где встречается комплементарный отсутствующему нуклеотид. Однако изредка ДНК-полимераза ошибается и включает один из трех присутствующих нуклеотидов. Это приводит к образованию кольцевых молекул, в составе которых присутствуют неспаренные некомплементарные азотистые основания. При введении таких векторов в клетки бактерий в части молекул произойдет репарация такого повреждения. В результате в половине молекул после репликации восстановится исходная последовательность, а в другой половине закрепится мутация. Отличить мутантные молекулы можно описанным выше способом.
Сайт-специфический мутагенез. Охарактеризованные методы локализованного мутагенеза отличаются тем, что сайты, где происходят мутации, выбираются случайно. В то же время техника сайт-специ-фического мутагенеза позволяет вводить мутации в точно определенный участок гена. Это осуществляется с использованием синтетических (полученных химическим синтезом) олигонуклеотидов с заданной последовательностью. Метод удобен тем, что не требует присутствия удобных сайтов рестрикции. В основу метода положено образование гетеродуплексов между синтетическим олигонуклеотидом, содержащим мутацию, и комплементарной однонитевой ДНК в составе вектора.
Поступают следующим образом. Синтезируют небольшой олигонуклеотид (8-20 мономеров), комплементарный той части гена, в которой хотят получить мутацию. В составе олигонуклеотида в центральной области допускают одну или несколько нуклеотидных замен. Клонируют исследуемый ген или его фрагмент в составе вектора на основе фага М13, чтобы получить кольцевые одноцепочечные рекомбинатные ДНК. Производят смешивание и отжиг рекомбинантных векторов с олигонуклеотидами. Происходит гибридизация олигонуклеотида с комплементарной областью, при этом некомплементарные нуклеотиды остаются неспаренными. Олигонуклеотид выполняет роль праймера в полимеразной реакции с участием ДНК-полимеразы in vitro. Кольцо замыкают лигазами. Полученная кольцевая молекула вводится в клетки E.coli, где происходит частичная репарация мутантных участков репликация. Частота мутаций обычно варьирует от 1 до 50%. Отбор клеток, содержащих мутантные молекулы ДНК, можно производить несколькими способами, среди которых преимущества имеет метод с использованием радиоактивно меченного олигонуклеотида, который применяется для мутагенеза. В данном случае этот нуклеотид служит зондом. Принцип использования такого зонда основан на том, что он полностью комплементарен мутантной ДНК и частично комплементарен ДНК дикого типа. Можно подобрать такие условия гибридизации (в первую очередь, температуру), что гибридизация меченого зонда будет стабильной только с мутантной последовательностью ДНК, что можно выявить на радиоавтографе.
Метод сайт-специфического мутагенеза особенно ценен тем, что позволяет изолировать мутации без контроля их фенотипического проявления. Этот метод открывает новые возможности исследования функций регуляторных элементов генов, позволяет изменять «силу» промоторов, оптимизировать сайты связывания с рибосомами и т. д. Одним из основных применений данной методологии является белковая инженерия.
Белковая инженерия. Этим словосочетанием обозначают комплекс методических приемов, которые позволяют реконструировать молекулу белка путем направленного введения соответствующих мутаций в структурный ген (сайт-специфический мутагенез) и, следовательно, желаемых аминокислотных замен в первичную структуру белка.
Показательным примером конструирования более активных белков являются эксперименты Фершта и сотрудников с ферментом тирозил-тРНК-синтетазой из бактерий Bacillus stearothermophilus. Анализ последствий замен аминокислот в активном центре этого фермента позволил заключить, что удаление групп, образующих с субстратом слабые водородные связи, может улучшить его сродство к субстрату. При этом обнаружено, что треонин-51 (занимает 51 положение в составе пептида) образует длинную и слабую водородную связь с кислородом кольца рибозы при связывании тирозиладенилата. В то же время обнаружено, что у бактерий E.coli такое же положение за нимает пролин. Сайт-специфический мутагенез гена, определяющего структуру тирозил-тРНК-синтетазы B.stearothermophilus, позволил обеспечить замену thr-51→pro -51 в пептиде. В результате резко улучшилось связывание АТР в активном центре фермента, а его каталитическая активность возросла в 25 раз.
Другим, не менее значимым примером реконструкции белка, имеющим практическое значение, является модификация субтилизина из Bacillus amyloliquefaciens, осуществленная Эстеллом и соавторами. Субтилизины представляют собой сериновые протеиназы, секретируемые бациллами во внешнюю среду. Эти ферменты выпускаются биотехнологической промышленностью в больших масштабах и широко используются в составе моющих средств. Недостатком субтилизинов является резкое уменьшение протеолитической активности под действием окислителей, в том числе содержащихся в стиральных порошках. Задача реконструкции молекулы субтилизина BPN заключалась в стабилизации его к химическому окислению.
В предварительных экспериментах было установлено, что в присутствии перекиси водорода субтилизин быстро снижает активность за счет окисления остатка метионина-222, превращающегося в соответствующий сульфоксид. Методами сайт-специфического мутагенеза была обеспечена замена этого остатка метионина на все остальные 19 белковых аминокислот. Плазмиды с мутантными генами вводили в штаммы с делециями в соответствующих генах и анализировали свойства продуцируемых субтилизинов. Достаточно стабильными к действию перекиси оказались мутанты с серином и аланином222. Самым активным оказался мутант, содержащий остаток цистеина-222, его удельная активность на 38% превышала активность штамма дикого типа.
Аналогичным путем удалось повысить активность b-интерферона. В числе других достижений белковой инженерии можно назвать исследования в выяснении трансформирующей активности онкобелков; изменение термостабильности ферментов, например получение термолабильного ренина и термостабильной a-амилазы; увеличение эффективности связывания инсулина соответствующим рецептором плазматической мембраны за счет замены гистидина на аспартат в положении 10 b-цепи гормона, а также множество других примеров. Большое количество продуктов белковой инженерии уже нашло практическое применение в производственных процессах.
-- [ Страница 1 ] --
Учебно-методическое обеспечение для подготовки кадров по программам высшего
профессионального образования для тематического направления ННС «Нанобиотехнологии»
Комплект 2
БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
НОУДПО «Институт «АйТи»
Учебно-методическое пособие. Часть 1: Тексты лекцийУчебно-методическое пособие. Часть 2: Методические рекомендации по изучению дисциплины
Учебно-методические материалы для практических занятий, семинаров, лабораторных работ и деловых игр
Дидактические материалы для работы профессорско-преподавательского состава. Учебные видео- и аудиоматериалы, слайды, эскизы плакатов.
Учебно-методическое обеспечение для подготовки кадров по программам высшего профессионального образования для тематического направления ННС «Нанобиотехнологии»
Комплект Раздел 4. Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров по программам высшего профессионального образования направления подготовки «Нанотехнология»
с профилем подготовки «Нанобиотехнологии»
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ МАГИСТРОВ ПО ДИСЦИПЛИНЕ
БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ
ЧАСТЬ 1: ТЕКСТЫ ЛЕКЦИЙ
НОУДПО «Институт «АйТи» Введение1. Предмет и задачи белковой инженерии
2. Постановка задачи и проведение эксперимента в белковой инженерии
3. Генно-инженерные методы белковой инженерии
Бесклеточная система экспрессии.
5. Экспрессия генов и препаративное получение целевых белков в практической белковой инженерии
6. Ренатурация генно-инженерных белков
Введение биологической активности в искусственные белки
8. Элиминирование отдельной биологической активности в рекомбинантных белках
Литература
УДК 577. ББК 28.
ВВЕДЕНИЕ
Задача дисциплины "Белковая инженерия"- обучить студентов базовым знаниям по предмету, которые включают в себя как основные теоретические представления, так и практические приемы работы с генами и рекомбинантыми белками, их направленному изменению и исследованию. В программу курса входят такие направления, как генноинженерные основы белковой инженерии (клонирование и экспрессия генов, полимеразная цепная реакция, мутагенез), основные методы получения рекомбинантных белков в различных экспрессирующих системах, выделение и очистка белков (включая ренатурацию), основные методы исследования рекомбинантных белков.К урс должен подготовить студентов к выполнению работ практикума по белковой инженерии, курсовых и дипломных проектов, связанных с получением и исследование рекомбинантных белков. Разделы курса охватывают такие темы, как предмет и задачи белковой инженерии, генно-инженерные методы белковой инженерии, постановка задачи и проведение эксперимента, системы экспрессии генов и их использование в практической белковой инженерии, оптимизация экспрессии и препаративное получение белков в белковой инженерии, ренатурация и очистка генно-инженерных белков. На конкретных примерах работы кафедры биоинженерии рассматриваются такие задачи, как получение искусственных белков с заданной структурой и свойствами и введение/элиминирование заданных биологических активностей. В целом, дисциплина "Белковая инженерия" представляет собой часть учебной подготовки магистров по профилю "Нанобиотехнологии", она посвящена работе с одним из важнейших биологических нанообъектов – белками и тесно связана с другими дисциплинами курса.
Белковая инженерия - направление молекулярной биологии и биоинженерии, целью которого является целенаправленное изменение структуры природных белков и получение новых белков с заданными свойствами. Белки – это важнейший биологический объект, без которого невозможно существование жизни, поэтому инженерия белков является неотемлемой составной частью инженерии биологических наноструктур. Природные белки приспособлены для функционирования в живых организмах, однако они зачастую не подходят для применения в биотехнологии и медицине в нативном виде – необходима их «оптимизация» для нужд человека. Именно такая оптимизация составляет задачу белковой инженерии.
Белковая инженерия возникла в начале 80-х годов 20 века, когда были разработаны основные методы генетической инженерии, позволившие получать различные природные белки с помощью бактерий или дрожжей, а также определенным образом изменять структуру генов и, соответственно, аминокислотную последовательность кодируемых ими белков. Необходимым условием появления белковой инженерии было развитие методов химического синтеза олигонуклеотидов, позволившее создавать искусственные фрагменты генов и целые гены, а также развитие теоретических методов предсказания и анализа структуры белков и физических методов их исследования. Исходя из принципов организации белковых молекул, взаимосвязи структуры и функции белков, белковая инженерия создат научно обоснованную технологию направленного изменения их структуры. С помощью белковой инженерии удатся повышать термостабильность белков, их устойчивость к денатурирующим воздействиям, органическим растворителям, изменять лиганд-связывающие свойства. Белковая инженерия позволяет путм замены аминокислот улучшать работу ферментов и их специфичность, изменять оптимальные значения рН, при которых работает фермент, исключать нежелательные побочные активности, устранять участки молекул, ингибирующие ферментативные реакции, повышать эффективность белковых лекарственных препаратов и т.д. Например, замена лишь одного остатка треонина на пролин позволила в 50 раз повысить активность фермента тирозил-тРНК-синтетазы, а благодаря замене 8 аминокислотных остатков термолизин-подобная протеаза из Bacillus stearothermophilus приобрела способность сохранять активность при 1000С в течение нескольких часов. К белковой инженерии можно отнести также работы по направленному изменению свойств белков с помощью химических модификаций, например, введение фотоактивируемых соединений, изменяющих свойства молекулы под действием света, соединений-меток, позволяющих отслеживать пути перемещения белка в клетке или направлять его к различным компонентам клетки и т.д. Такие работы проводятся преимущественно на рекомбинантных белках, получаемых с помощью генно-инженерных методов.
В современной белковой инженерии можно выделить два направления:
рациональный дизайн и направленная молекулярная эволюция белков. Первое подразумевает использование информации о структурно-функциональных отношениях в белках, получаемой с помощью физико-химических и биологических методов, а также компьютерного молекулярного моделирования, для того, чтобы определить, какие именно изменения в первичной структуре должны привести к желаемому результату. Так, для повышения термостабильности белка необходимо определить его пространственную структуру и выявить "слабые" участки, например, аминокислоты, недостаточно сильно связанные со своим окружением. Затем подобрать для них наилучшие варианты замен на другие аминокислоты с помощью молекулярного моделирования и оптимизации энергетических параметров молекулы, После этого нужно подвергнуть мутации соответствующий ген, а затем получить и исследовать мутантный белок. Если этот белок не удовлетворяет заданным параметрам, проводят новый анализ и повторяют описанный цикл.
Это направление наиболее адекватно выражено в случае конструирования искусственных белков (белков de novo) с заданными свойствами, когда на входе имеется новая аминокислотная последовательность белка, в основном или полностью заданная человеком, а на выходе – белковая молекула с желаемыми характеристиками. Пока, однако, таким образом удатся получать только небольшие белки de novo с несложной пространственной структурой и вводить в них простые функциональные активности, например, металлсвязывающие участки или короткие пептидные фрагменты, несущие какие-либо биологические функции.
При направленной молекулярной эволюции белков с помощью генно-инженерных методов получают большой набор различных мутантных генов целевого белка, которые затем экспрессируют специальным образом, например, на поверхности фагов ("фаговый дисплей") или в бактериальных клетках, с тем, чтобы сделать возможным отбор мутантов с лучшими характеристиками. С этой целью, например, гены нужного белка или его частей встраиваются в геном фага в состав гена, кодирующего белок, расположенный на поверхности фаговой частицы. При этом каждый индивидуальный фаг нест свой мутантный белок, обладающий определенными свойствами, по которым делается отбор. Мутантные гены получают путм "перемешивания" набора генов сходных природных белков различных организмов, как правило, с помощью метода полимеразной цепной реакции, так что каждый получаемый мутантный белок может включать в себя фрагменты многих "родительских" белков. По сути, этот подход имитирует природную эволюцию белков, но только существенно более быстрыми темпами. Основная задача белкового инженера в данном случае заключается в разработке эффективной селектирующей системы, которая позволит отбирать лучшие мутантные варианты белков с нужными параметрами. В случае вышеупомянутой задачи – повысить термостабильность белка, отбор можно вести, например, путм выращивания клеток, содержащих мутантные гены, при повышенной температуре (при условии, что присутствие в клетке мутантного белка увеличивает е температурную устойчивость).
Оба названных направления белковой инженерии имеют одну цель и дополняют друг друга. Так, исследование получаемых с помощью методов молекулярной эволюции мутантных вариантов белков позволяет лучше понять структурно-функциональную организацию белковых молекул и использовать полученные знания для целенаправленного рационального дизайна новых белков. Дальнейшее развитие белковой инженерии дат возможность решать многие практические задачи по улучшению природных и получению новых белков для нужд медицины, сельского хозяйства, биотехнологии. В будущем возможно создание белков, обладающих функциями, неизвестными в живой природе.
Настоящий курс белковой инженерии включает в себя как основные теоретические представления, так и практические приемы работы с генами и рекомбинантыми белками, их направленному изменению и исследованию. Этот курс находится в неразрывной связи с другими дисциплинами программы подготовки магистров, прежде всего, с дисциплиной "Молекулярная биоинженерия", частью которой, фактически, является. Белковая инженерия и рациональный дизайн белков обязательно включают в себя элементы компьютерного моделирования, поэтому они связаны с дисциплиной "Молекулярное моделирование нано-и биоструктур" и более общей дисциплиной "Компьютерные технологии в науке и образовании". Изучение свойств получаемых с помощью белковой инженерии рекомбинантных белков требует применения современных методов их исследования, таких как конфокальная и атомно-силовая микроскопия, компьютерная томография, электронная микроскопия, поэтому белковая инженерия связана с соответствующими дисциплинами, посвященными данным методам. Объектом белковой инженерии являются белковые наноструктуры, поэтому очевидна ее связь с дисциплиной "Основы нано- и биобезопасности". Таким образом, дисциплина "Белковая инженерия" представляет собой неотемлемую часть подготовки магистров по профилю "Нанобиотехнологии" направления "Нанотехнологии".
Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. Дать определение термина "Белковая инженерия" 2. Чем белковая инженерия отличается от других видов инженерии?
3. Каковы предпосылки появления белковой инженерии?
4. Какие задачи может решать белковая инженерия?
5. Какие направления белковой инженерии Вы знаете?
6. Что такое направленная молекулярная эволюция белков?
7. Как белковая инженерия связана с другими разделами нанобиотехнологии?
2. Постановка задачи и проведение эксперимента в белковой инженерии Белки представляют собой важнейший компонент живых организмов, они выполняют целый ряд функций: каталитические, регуляторные, структурные, транспортные и другие. Белки состоят из последовательно соединенных аминокислотных остатков (первичная структура белка), образующих, как правило, регулярные элементы - вторичную структуру, в которой аминокислотные остатки соединены между собой водородными связями,. Основными элементами вторичной структуры белка являются альфа-спираль и бета-структура, исследователи выделяют также и другие, менее распространенные регулярные элементы – спираль 310, пи-спираль, бета-изгибы и другие элементы, о которых вы можете узнать в курсе физики белка (А.В.Финкельштейн, О.Б.Птицын, Физика белка).
Часть аминокислотных остатков белка, порой весьма существенная часть, имеет неупорядоченную структуру, которую называют еще клубкообразной. Можно условно выделить три класса белков: глобулярные, фибриллярные и мембранные, и все три эти класса являются объектом для белковой инженерии.
На первом рисунке показана иерархия структур белковой молекулы. В альфаспиральной структуре водородные связи соединяют остатки i и i+3 и, таким образом, образуется геометрия спирали. В бета-структуре соединены водородными связями расположенные рядом линейные участки аминокислотной последовательности (участок с показанными пунктиром водородными связями справа от выделенной синим цветом альфаспирали на рисунке 1). Альфа-, бета- и другие структуры, будучи уложены определенным образом, формируют пространственную или третичную структуру белка. И, наконец, белки могут быть соединены друг с другом в четвертичную структуру – клубок белков (отметим, однако, что это вовсе не хаотичный, а высоко упорядоченный клубок, где каждому белку отводится свое место).
Что же может белковая инженерия и какие свойства белков изменяют белковые инженеры? Современная белковая инженерия может многое. В частности, для ферментов она позволяет следующее (Таблица):
увеличивать Vmax, то есть максимальную скорость ферментативной реакции, уменьшать константу Михаэлиса Km, измененять оптимальные значения рН, при которых работает фермент;
устранять «плохие» остатки и участки белка, ингибирующие ферментативную реакцию;
изменять специфичность работы ферментов.
Можно изменять также структурные свойств ферментов и других белков:
улучшать термостабильность;
улучшать стабильность к органическим растворителям;
изменять лиганд-связывающие свойства.
Наконец, можно получать новые белковые системы:
получать химерные и полифункциональные белки, - белки с «тагами» (от английского "tag" – привесок, обрывок) то есть со специальными полипептидными "хвостиками", которые могут, например, облегчать выделение и очистку, уменьшать токсичность решать сложные задачи по улучшению эффективности белковых лекарственных создавать совершенно новые искусственные («de novo») белки с заданной структурой и В литературе описано большое количество работ по белковой инженерии и далее в настоящем курсе мы будем подробно рассматривать некоторые типичные работы, выполненные на кафедре белковой инженерии. Начнем с рассмотрения основных этапов работы белкового инженера - схему эксперимента.
Постановка задачи, анализ, моделирование Получение экспрессирующей системы (плазмида, Оптимизация экспрессии, получение белка Исследование рекомбинантного белка Вначале исследователю необходимо решить, с каким белковым объектом и почему он собирается работать – это этап постановки задачи, требующий получения необходимой информации, анализа литературы, возможно, моделирования. Затем нужно получить ген того белка, с которым предстоит работать. Это довольно простой этап - ген можно получить, например, клонированием с кДНК, то есть с искусственно (с помощью специального фермента) полученной ДНК, комплиментарной матричным РНК организма, кодирующим все его белки. (Хромосомная ДНК в этом смысле хуже, т.к. в ней гены могут прерываться интронами, т.е. некодирующими участками). Ген можно также синтезировать химически, что иногда предпочтительнее, т.к. при этом можно сразу убрать редкие кодоны, затрудняющие экспрессию гена. Наконец, можно просто попросить у коллег (если он уже получен где-то) – вполне могут дать и даже прислать из-за рубежа. Затем надо получить систему экспрессии, то есть выбрать организм, в котором вы собираетесь производить белок и заставить его эффективно нарабатывать ваш белок. Обычно у нас это E.coli, но можно использовать и дрожжи, и клетки насекомых – бакуловирусная система, – и клетки млекопитающих, и бесклеточную систему экспрессии. Создание системы экспресии включает в себя получение экспрессирующей плазмиды и оптимизацию экспрессии, то есть подбор условий, в которых система будет производить наибольшее количество белкового продукта (или наибольшую долю растворимого белка, или наибольшую долю белка в составе телец включения – в зависимости от конкретного объекта и дальнейшей схемы его выделения и очистки). Это уже более сложная задача, которую не всегда удается решить. Проблемы могут быть разные – токсичный для клетки белок, его быстрый распад, неправильное сворачивание белка и, как следствие, отсутствие необходимой активности и т.д. Но если удается преодолеть эти проблемы и белок, наконец, получен, его можно детально исследовать различными физикохимическими методами, проанализировать, понять, как он работает и решить, что и зачем нужно поменять, то есть поставить задачу для работы белкового инженера. Иногда бывает и так, что менять ничего не надо – например, получен важный для медицины белок, который и так хорошо работает. Но даже в этих случаях часто возникают интересные вопросы и задачи, которые требуют работы белкового инженера. А когда мы знаем, что хотим улучшать, какой остаток или остатки изменить, мы используем мутагенез, получаем мутантные гены с необходимыми аминокислотными заменами и опять возвращаемся к началу схемы. Цикл повторяется, вновь идет исследование, анализ результата, возможно, постановка следующей задачи и т.д. И, таким образом, порой нужно пройти несколько таких последовательных стадий, прежде чем удастся получить что-то действительно нужное и интересное.
Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. Какие элементы белковых структур Вы знаете?
2. Опишите схему эксперимента в белковой инженерии.
3. Придумайте пример задачи для работы белкового инженера.
4. Какие свойства белков можно изменять с помощью белковой инженерии?
5. Какова последовательность действий белкового инженера при решении типичной 3. Генно-инженерные методы белковой инженерии Генно-инженерные методы составляют экспериментальную основу белковой инженерии, поэтому исследователи, работающие в этой области, должны хорошо владеть основными генно-инженерными приемами и методиками. Это, прежде всего, рестрикция и лигирование плазмид и фрагменов ДНК, использование полимераз, в том числе, термостабильных полимераз для полимеразной цепной реакции, проведение мутагенеза.
К наиболее важным ферментам, применяющимся в генетической и белковой инженерии, относятся специфические эндонуклеазы – рестриктазы, с помощью которых получают фрагменты ДНК воспроизводимого состава и длины, а также ДНК-лигазы, объединяющие эти фрагменты.
Рестриктазы и метилазы В бактериях чужеродная ДНК, проникающая в клетки, гидролизуется (рестрицируется) с помощью специальных эндонуклеаз – рестриктаз, являющихся элементами системы рестрикции-модификации. Рестриктазы узнают в чужеродной ДНК определенные специфические для каждого фермента последовательности нуклеотидов – сайты узнавания – и расщепляют эту ДНК на отдельные фрагменты. Собственную ДНК рестриктазы не разрушают, поскольку она в этих же участках модифицируется сайтспецифическими метилазами. Метилазы – ферменты, присоединяющие метильную группу к определенным азотистым основаниям в ДНК. Они практически не используются в белковой инженерии, однако необходимо помнить о их существовании при проведении рестрикции, так как они (точнее, результат их работы – метилирование) могут препятствовать расщеплению ДНК рестриктазами. Ферменты рестрикции и модификации найдены практически у всех исследованных видов бактерий. Они могут также кодироваться фагами и плазмидами. Название рестриктаз складывается из первой буквы рода бактерий, и двух первых букв вида, например, Bacillus subtilis – Bsu, E.coli - Eco. При необходимости дается типовая характеристика штамма, например, Hinc обозначает фермент из клеток Haemophilus influenzae с серотипом с. Различные системы рестрикции одного и того же вида бактерий нумеруются римскими цифрами (PvuI и PvuII из Proteus vulgaris, AvaI и AvaII из Anabaena variabilis). С учетом основных свойств системы рестрикции-модификации подразделяются на 4 класса. Различия касаются: субъединичности строения, потребности в кофакторах, симметрии сайтов узнавания; положения сайтов разрезания относительно сайтов узнавания.
Более детальную характеристику различных рестриктаз можно найти в учебниках по генной инженерии, нас же для целей практической белковой инженерии, в первую очередь, интересуют рестриктазы второго класса, которые узнают симметричную последовательность из 4-8 нуклеотидов (могут также содержать несколько добавочных нуклеотидов в форме неспецифичных вставок). Сайты разрезания совпадают с сайтами узнавания или находятся рядом с ними на строго определенном расстоянии, что позволяет получать рестрикты строго определенной длины. Поэтому они широко применяются для самых различных целей, например, физического картирования ДНК, анализа полиморфизма ДНК, генетического конструирования рекомбинантных молекул in vitro; рестрикционный может использоваться в качестве точки отсчета при секвенировании ДНК и т.д. По способу расщепления рестриктазы второго класса подразделяются на 2 типа. Одни осуществляют ступенчатый разрез нитей, т.е.
положения гидролизуемых связей на разных цепях ДНК не совпадают. В результате у фрагментов ДНК образуются выступающие однонитевые концы. Очевидно, в местах разрезов выступающие последовательности нуклеотидов, относящиеся к разным нитям ДНК, являются комплиментарными (липкими) (рисунок 3). При этом выступать могут как 5’концы (например, при обработке ДНК рестриктазой EcoRI), так и 3’-концы (например, при обработке ДНК рестриктазой PstI). Другие рестриктазы второго класса осуществляют прямой разрез нитей ДНК - расщепляются совпадающие связи. В результате у фрагментов ДНК образуются ровные (тупые) концы (например, при обработке ДНК рестриктазой SmaI).
5’-N-N-С-T-G-C-A-G-N- 3’ PstI 5’-N-N- С-T-G-C-A-3’ 5’-G-N-3’ Рис. 3. Классификация рестриктаз по способу расщепления ДНК.
Для целей практической белковой инженерии – получения фрагментов ДНК и их последующего сшивания и/или введения в состав плазмид с помощь фермента лигазы используются и те и другие, однако на практике удобнее работать с липкими концами.
Многие рестриктазы, выделенные из разных бактерий, узнают на ДНК одинаковые сайты.
Такие рестриктазы называют изомерами. Они подразделяются на изошизомеры и гетерошизомеры. – одни узнают одинаковые сайты и одинаково их разрезают (например, рестриктазы HindIII и HsuI), а вторые расщепляют эти сайты по-разному (например, Asp718I и KpnI). Главные условия для работы рестриктаз – определенная температура и состав буфера (рисунок 4).
Оптимальная температура действия для большинства рестриктаз - 37оС. Но, например, рестриктаза SmaI предпочитает 25оС, а рестриктазы, выделенные из термофильных бактерий (например, TaqI), эффективны при 65оС. С целью удобства в работе для большинства рестриктаз существуют унифицированные варианты буферных растворов, в которых проводится реакция рестрикции. Важным условием работы рестриктаз является правильная ионная сила буферного раствора – в противном случае может наблюдаться т. наз.
"звездная активность", при которой рестриктаза может терять специфичность, т. е.
расщеплять ДНК не только в своем сайте рестрикции. Когда расщепление ДНК ведут двумя или большим количеством рестриктаз, то их добавляют одновременно при условии, если они способны правильно работать в одинаковом буфере. В противном случае первым используется фермент, требующий меньшей ионной силы. После его действия ионную силу раствора повышают и добавляют второй фермент. Типичный ферментативный гидролиз ДНК ведут в объеме 20 мкл, используя 0.1-1 мкг ДНК, 1 единицу фермента и буфер для его работы. Единица фермента (единица активности фермента) – количество рестриктазы, необходимое для полного расщепления 1мкг ДНК фага за 1 ч при рекомендованных условиях. Но в ряде случаев, когда сайтов узнавания для данной рестриктазы нет в ДНК фага, используются другие охарактеризованные молекулы - pBR322, аденовирусная ДНК.
Разнообразные генетические процессы (репликация, рекомбинация, репарация), протекающие в клетке, сопровождаются появлением в двунитевых молекулах ДНК ников, т.е. однонитевых разрывов. В таких молекулах 3’-ОН и 5’-р-концы разорванных полинуклеотидных цепей удерживаются вместе с помощью водородных связей с комплементарной нитью. ДНК-лигазы – ферменты, объединяющие подобные цепи путем восстановления фосфодиэфирной связи между двумя соседними полинуклеотидами.
Наиболее изучены ДНК-лигазы E.coli и фага Т4. Энергию, необходимую для образования ковалентных связей, эти ферменты черпают у кофакторов – макроэнергов НАД+ (бактериальная лигаза) или АТФ (фаговая лигаза). В обоих случаях ферменты аденилируются, а затем переносят АМФ на 5’-концы полинуклеотидных цепей в местах разрывов, что сопровождается восстановлением макроэнергетических пирофосфатных связей. Запасенная таким образом энергия тратится на образовангие фосфодиэфирных связей между соседними 3’-ОН и 5’-р-концами, что приводит к залечиванию ников и освобождению АМФ. Бактериальную и фаговую ДНК-лигазы используют для сшивания (лигирования) рестриктов. Оптимальная температура лигирования ДНК в никах 37оС, но при данной температуре энергии водородных связей между липкими концами рестриктов недостаточно для их удержания в совместном комплексе в момент реакции. Поэтому лигирование рестриктов проводят при пониженных температурах (4 – 12оС). ДНК-лигазу фага Т4 применяют в реакции объединения двунитевых фрагментов ДНК, содержащих тупые концы. Она катализирует образование фосфодиэфирных связей в обеих нитях.
Лигирование тупых концов обычно проводят при температурах 16 – 22оС.
ДНК-полимеразы – ферменты, ведущие матричный синтез ДНК в направлении 5’3’. Для этой цели им обязательно требуется праймер со свободной 3’ОН-группой. Более подробно познакомимся с ДНК-полимеразами на примере ДНК-полимеразы I E.coli.
ДНК-полимераза I E.coli. Этот фермент состоит из одной полипептидной цепи, и обладает тремя видами активности. Полимеразная активность обуславливает синтез цепи ДНК в направлении 5’3’. Он осуществляется на однонитевой матрице в присутствии dNTP присоединением нуклеотидных остатков к 3’ОН-концу комплементарной нити, являющейся в этом случае праймером. Экзонуклеазная активность в направлении 5’3’ вызывает отщепление нуклеотидов с 5’р-концов двунитевых молекул ДНК и приводит к их деградации. Экзонуклеазная активность в направлении 3’5’ приводит к отщеплению нуклеотидов с 3’ОН-концов одно- и двунитевых молекул ДНК. Данная активность на двуцепочечной ДНК блокируется 5’3’ полимеразной активностью. Эта ДНК-полимераза может вести одновременно полимеризацию и гидролиз нуклеотидной цепи в направлении 5’3’, начиная с однонитевого разрыва (ника) в двунитевой ДНК. При этом ник перемещается вдоль цепи ДНК (этот процесс назван ник-трансляцией), что и используется для введения в ДНК in vitro меченных нуклеотидов. Раньше ее использовали также при синтезе 2-ой цепи кДНК, в настоящее время для этой цели используется обратная транскриптаза или фрагмент Кленова ДНК полимеразы I. От ДНК-полимеразы I с помощью трипсина или субтилизина можно отделить домен, называемый фрагментом Кленова, который сохраняет полимеразную и 3’5’ экзонуклеазную активности. Отсутствие в кленовском фрагменте 5’3’ экзонуклеазной активности позволяет использовать его для заполнения нуклеотидами выступающих однонитевых 5’-концов, образующихся при ступенчатом разрезании ДНК рестриктазами. Фрагмент Кленова используется 1) для превращения липких концов ДНК в тупые для последующего лигирования; 2) для синтеза второй нити кДНК; 3) для концевого включения метки в фрагменты ДНК; 4) для секвенирования по методу Сэнгера.
ДНК-полимераза фага Т4. Этот фермент обладает теми же активностями, что и фрагмент Кленова. Однако 3’5’ экзонуклеазная активность этой полимеразы более эффективна.
ДНК-полимераза фага Т7. Этот фермент обладает теми же активностями, что и фрагмент Кленова. Он состоит из двух субъединиц: продукта гена 5 фага Т7 и вспомогательного белка тиоредоксина E.coli. Последний повышает стабильность комплекса фермент-матрица и увеличивает процессивность полимеразы более, чем в 1000 раз.
Благодаря этому его используют для копирования относительно длинных матриц. Для секвенирования по Сэнгеру используют модификации этой полимеразы, у которых экзонуклеазная активность подавлена. Эти модификации получили название сиквеназ.
Широкое распространение в генно-инженерной практике получили термостабильные ДНК-полимеразы, о которых речь пойдет позднее.
Полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение 2-3 часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в сотни миллионов раз. На рисунке 4 показана схема полимеразной цепной реакции.
При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие интересующий нас участок ДНК. Эффект умножения специфической последовательности ДНК достигается путем многократного повторения (25-30 циклов) трех последовательных реакций: 1) температурной денатурации ДНК, 2) связывания (отжига) праймеров с комплементарными последовательностями ДНК, т.е. образования двухцепочечных "комплексов" праймер-матрица, необходимых для инициации синтеза ДНК;
и 3) последующей достройки цепей ДНК с этих праймеров в направлении от 5’-конца к 3’концу цепи, начиная с участков присоединения праймеров, при помощи термостабильной ДНК-полимеразы. Праймеры на матрице ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. При этом длинные фрагменты, синтезируемые на исходной цепи ДНК, накапливаются по формуле арифметической прогрессии, а короткие дискретные фрагменты, ограниченные на концах праймерами, которые впервые появляются только в конце второго цикла ПЦР, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.
Смена типа реакции задается изменением температуры реакционной смеси.
Температура денатурации определяется ионной силой используемого буфера и концентрацией дестабилизирующих ("денатурирующих") ДНК агентов (если они есть). Чем ниже ионная сила и чем выше концентация "денатурирующих" агентов, тем ниже температура, при которой происходит денатурация ДНК. Температура отжига определяется строением праймера. Температура полимеризации определяется свойствами используемой полимеразы (например, для Taq-полимеразы это 72оС). В настоящее время метод ПЦР автоматизирован, довольно прост в исполнении и доступен любой молекулярнобиологической лаборатории. Для получения ответа на интересующие вас вопросы дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, ДНК-полимеразу, концентрированный буферный раствор и поместить пробирку в программируемый термоциклер (амплификатор), который по заданной программе автоматчески проводит смену температур. Число циклов ПЦР ограничено, с одной стороны, частичной инактивацией полимеразы и истощением участвующих в реакции праймеров и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, а с другой - тем, что избыточное число циклов приводит к наработке продуктов неспецифической амплификации. В большинстве случаев для проведения ПЦР достаточно 25-30 циклов.
Для подбора праймеров можно использовать простые компьютерные программы, например Oligo. Требования к нуклеотидной последовательности праймера можно свести к следующим условиям: 1) отсутствие вторичной структура (праймер не должен образовывать петли); 2) сбалансированный состав ГС, АТ-пар и равномерное распределение ГС, АТ по всей последовательности; 3) праймеры не должны быть гомологичны друг другу.
Выбор температуры отжига праймеров, возможно, один из ключевых факторов для обеспечения высокоспецифичной ПЦР. Если температура окажется завышенной, отжиг не будет происходить, если будет занижена – резко увеличится неспецифический отжиг, что привет к синтезу неспецифических продуктов.
Для точного расчета оптимальной температуры отжига праймера (по его нуклеотидному составу) существует множество различных программ и алгоритмов.
Упрощенный расчет можно провести, используя следующие формулы:
если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований.
Tm = 22 + 1.46( + (A+T)), или где M - ионная сила раствора, L - длина олигонуклеотида, если суммарная длина олигонуклеотида составляет 20-30 оснований.
В ПЦР используются термостабильные ДНК-полимеразы; одна из самых популярных из них - Taq-полимераза. Фермент изначально был выделен из термофильных бактерий Thermus aquaticus, поэтому он сам термостабилен – реплицирует ДНК при 72оС и сохраняет половину своей функциональной активности после прогрева при 95оС в течение одного часа. Фермент обладает 5’3’ экзонуклеазной активностью, но редакторская 3’5’ экзонуклеазная активность у него слабая. Поэтому Taq-полимераза имеет довольно высокий процент ошибочного (некомплиментарного) включения нуклеотидов in vitro. Теми же активностями что и Taq-полимераза, обладает Tth-полимераза (выделена из термофильных бактерий Thermus thermophilus). Часто используются ДНК-полимеразы Vent и Deep Vent, которые происходят из бактерий, найденных в глубоководных термальных источниках.
Полимеразы высоко термостабильны: сохраняет половину своей функциональной активности после прогрева при 95оС в течении 7 (Vent) и 23 (Deep Vent) часов. Ферменты обладают 3’5’ экзонуклеазной активностью, поэтому точность синтеза повышена на порядок по сравнению с Taq-полимеразой. Pfu- полимераза – еще один фермент, выделенный из термофильных бактерий. Обладает теми же активностями что и Vent и Deep Vent ДНКполимеразы, при этом точность синтеза выше, чем у этих полимераз.
Клонирование ПЦР-фрагментов. При клонировании ПЦР-продукта нужно помнить о некоторых особенностях работы определенных термостабильных полимераз. Taq и Tthполимеразы имеют специфическую особенность навешивать дополнительные адениловые остатки к 3’-концу ПЦР-продукта. Такие фрагменты не могут быть клонированы, их необходимо подвергнуть предварительной обработке. Для этого используются различные способы: «полирование концов продуктов» – достраивание синтезированной ДНК с помощью фрагмента Кленова, с последующим фосфорилированием, которая осуществляет полинуклеотид киназа. Можно также вводить в используемые праймеры дополнительные сайты рестрикции. С этой целью дополнительная последовательность нуклеотидов синтезируется на 5’-конце праймеров. В первом цикле праймеры связываются с ДНК только своей 3’-концевой частью, но уже в последующих циклах дополнительная последовательность включается в синтезируемую ДНК и праймеры гибридизуются с ней по всей длине. Так обычно снабжают синтезированный ПЦР-продукт сайтами рестрикции, обеспечивая с их помощью возможность его дальнейшего клонирования.
Область применения ПЦР велика и постоянно расширяется – рисунок 5.
1. Клонирование нуклеотидных последовательностей;
6. Обнаружение генетического материала микроорганизмов Рис. 6. Области применения полимеразной цепной реакции.
Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. Какие генно-инженерные методы используются в белковой инженерии?
2. Какие ферменты, используемые в белковой инженерии, Вы знаете?
3. Какие типы рестриктаз Вы знаете?
4. Могут ли рестриктазы расщеплять метилированные участки ДНК?
5. Что такое ПЦР?
4. Системы экспрессии генов. Прокариотические и эукариотичексие системы.
Как уже было сказано, получить ген сейчас достаточно просто, а вот получить хорошую систему экспрессии для производства белка удается не всегда. В настоящее время применяются следующие способы экспрессии:
1. Прямая экспрессия, когда белок синтезируется со своего гена, включенного в плазмиду и поставленного под контроль необходимых регуляторных элементов, не имеет никаких вспомогательных "довесков" и остается в цитоплазме;
2. Гибридная экспрессия – то же самое, но с довеском в виде белка-помощника, находящегося на N-конце полипептидной цепи и отщепляемого (или не отщепляемого) впоследствии;
3. Секреция, когда белок выводится в периплазматическое пространство (пространство между внутренней мембраной - фосфолипидным бислоем, - и внешней мембраной клетки, состоящей из пептидогликанового слоя и своего фосфолипидного бислоя;
периплазма важна для осморегуляции клеток, в ней находятся некоторые белки) или Каждый из способов имеет свои особенности. При прямой экспрессии ген целевого белка ставится в плазмиду под контроль хорошего промотера, который, впрочем, обеспечивает эффективный синтез далеко не всегда: гетерологичный ген может иметь "неправильную" последовательность, например, образующую в мРНК вторичную структуру, продукт синтеза может разрушаться клеточными протеазами или быть токсичен для клеткихозяина. Цель гибридной экспрессии – "перехитрить" клетку, заставив ее эффективно начать синтез N-концевой части белка-помощника, в качестве которого берут белок, заведомо хорошо экспрессируемый хозяйской клеткой (т. наз. house-keeping белки - "белки домашнего хозяйства"). После же начала синтеза ген белка-помощника переходит в целевой ген, так что получаемая полипептидная цепь представляет собой целевой белок с небольшим довеском от белка-носителя на N-конце. При необходимости этот довесок можно отщепить с помощью высокоспецифических протеаз (для этого между геном белка-помощника и целевым геном вводится специальный участок, кодирующий сайт расщепления такой протеазы. Секреция позволяет вывести вновь синтезированный целевой белок в периплазму или за пределы клетки, что может облегчить его последующее выделение и очистку. Кроме того, таким образом можно иногда получить эффективную эспрессию белков, токсичных для клетки, так как синтезированная полипептидная цепь выводится за пределы цитоплазмы.
По клеткам-хозяевам системы экспрессии можно разделить на прокариотические и эукариотические. Традиционно получили большое распространие прокариотические системы экспрессии, прежде всего, экспрессия в E.coli. Среди ее достоинств – простота и доступность, возможность достижения высокого уровня продукции целевых белков, хорошая воспроизводимость результатов, относительная дешевизна, изученность свойств хозяина – клеток E.coli. К недостаткам надо отнести отсутствие ко- и пост-трансляционных модификаций гетерологичных белков, например, белков человека, нативность и полное соответствие природным которых весьма важно для их использования в качестве лекарственных препаратов. Также достаточно давно ведутся работы по экспрессии в дрожжах – эта эукариотическая система экспрессии тоже хорошо изучена и отработана.
Уровень экспрессии белков здесь обычно ниже, чем в E.coli, однако, он бывает достаточно высок (например, в дрожжах Pichia pastoris). Дрожжи обеспечивают часть ко- и посттрансляционных модификаций гертерологичных белков, однако эти модификации могут отличаться от "родных", т.е., тех модификаций, которые имеет данный белок в своем природном организме-хозяине. Другая достаточно часто используемая эукариотическая система экспрессии - это бакуловирусная система, когда белки экспрессируются в клетках насекомых, зараженных бакуловирусом, который несет ген целевого белка. В последнее время все большее распространение получают системы экспрессии в клетках млекопитающих, например, СНО - клетках яичника китайского хомячка. Такие системы экспрессии позволяют полностью избежать проблем с ко- и пост-трансляционными модификациями белка (которые могут быть "неправильными" у дрожжей и вообще отсутствовать у E.coli). Значительная часть современных белковых лекарственных препаратов производится именно в клетках млекопитающих, и эта часть, несомненно, будет расти. И это несмотря на высокую стоимость экспрессии в клетках млекопитающих.
Причина заключается в том, что в цене лекарственного препарата-белка доля затрат на собственно производство белка составляет всего несколько процентов, а все остальное – это расходы на НИР по разработке препарата, на его доклиническое и клиническое тестирование, продвижение на рынок и т.д. И если белковый препарат, условно говоря, стоит на рынке 1000 долларов, то не столь уж важно, составляет ли стоимость его производства на фармацевтическом заводе 10, 50 или 100 долларов.
Мы не будем сейчас останавливаться на "традиционных" способах экспрессии (о которых можно прочитать в учебниках), а рассмотрим подробнее бесклеточные системы, которые не столь сильно распространены, но обладают уникальными возможностями.
Бесклеточные белоксинтезирующие системы - одна из самых сложных многокомпонентных наносистем, используемых молекулярными биологами in vitro. Это связано с необходимостью точного воспроизведения всех этапов биосинтеза белка, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и трансляцию мРНК рибосомами. Бесклеточные системы были вначале разработаны именно для исследования механизмов биосинтеза белка, и только потом стало понятно, что с их помощью можно также нарабатывать рекомбинантные белки и пептиды в аналитических, а затем и препаративных количествах.
В бесклеточную систему обязательно входит клеточный экстракт, получаемый после разрушения клеток и освобождения супернатанта от дебриса (и содержащий многие необходимые для синтеза компоненты, роль которых порой неясна), а также матричная РНК с геном целевого белка, аминокислоты, источник энергии (ГТФ) и другие химические соединения, значение которых в процессе синтеза, напротив, хорошо известно. Клеточный экстракт – важнейший компонент бесклеточной системы, его получение – своего рода искусство, которое требует строгого соблюдения протоколов, точности и аккуратности; от качества экстракта зависит эффективность работы системы. Химические соединения, роль которых в процессе синтеза известна, могут добавляться в реакцию в модифицированном виде и это - одно из существенных преимуществ бесклеточной системы. Например, если вместо обычных аминокислот добавить их изотопно меченные (15N и/или 13С) аналоги, то эффективность работы системы практически не изменится, а синтезированный белковый продукт будет пригоден для детального структурного исследования методом ЯМР.
Напротив, в клеточных системах экспресии получение изотопно меченного продукта представляет достаточно сложную задачу. Еще одно очевидное преимущество бесклеточной системы – возможность синтеза токсичных для живой клетки белков, которые могут быть не столь токсичны для белок-синтезирующей машины бесклеточной системы.
Бесклеточные системы экспресии, подобно другим системам, можно разделить на прокариотические и эукариотические – в зависимости от используемого клеточного экстракта. Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. coli, среди эукариотических – на основе ретикулоцитов кроликов и зародышей пшеницы. Естественно, что наиболее эффективно различные белки производятся в гомологичных бесклеточных системах, однако и чужеродные мРНК могут быть весьма успешно транслированы. При этом мРНК может либо нарабатываться в необходимых количествах in vitro заранее и добавляться в реакцию, или же синтезироваться в процессе самой реакции параллельно с трансляцией такая система называется сопряженной. Бесклеточные системы экспресии весьма дороги, поэтому их чаще используют в аналитическом варианте, когда объем пробы не превышает 100 мкл. При этом система обычно работает несколько часов, затем эффективность синтеза падает вследствие деградации ее компонентов, накопления продуктов реакции, ингибирующих процесс и т.п. Этого можно избежать, используя проточную белоксинтезирующию систему, в которой непрерывно происходит удаление продуктов реакции и добавление расходуемых веществ, необходимых для работы системы.
Экстракты клеток, используемые в бесклеточных системах, содержат многочисленные нуклеазы и протеолитические ферменты, которые понижают эффективность синтеза белков, разрушают мРНК и образуемые полипептиды. Для преодоления этих проблем в бесклеточных системах могут использоваться экстракты мутантных клеток, дефектных по РНКазам и полинуклеотидфосфорилазе, а в сами бесклеточные системы вводят ингибитор РНКазы из плаценты человека или ингибиторы протеиназ: лейпептин, пепстатин, химостатин и т.п. Для функционирования бесклеточных белоксинтезирующих систем необходимо обеспечивать в них определенные ионные условия, особенно концентрацию ионов Mg2+. Достаточно изменения оптимальной концентрации Mg2+ в системе на 1-2 мМ, чтобы в ней перестали синтезироваться полипептиды, обладающие ферментативной активностью. Влияние ионов Mg2+ на суммарное включение аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи проявляется в меньшей степени, что, повидимому, объясняется нарушением точности включения аминокислот в белки при неоптимальных концентрациях ионов Mg2+. В системах in vitro ионы Mg2+ могут быть заменены на ионы Са2+ и даже Мn2+, а также частично замещены полиаминами:
спермидином или спермином, которые благоприятно влияют на трансляцию и образование нативных белков. Биосинтез белка в бесклеточных системах происходит также в присутствии ионов K+ или NH4+, оптимальные концентрации которых составляют около 100 мМ. Ионы Na+ ингибируют трансляцию, а ацетат-анионы в используемых солях предпочтительнее анионов Сl-. Ионы Mg2+, К+ и NH4+ необходимы для ассоциации субчастиц рибосом и поддержания их в компактной форме.
Для производства белков человека и других высших организмов применяются эукариотические бесклеточные системы, в частности, системы из ретикулоцитов кроликов и зародышей пшеницы, а также системы на основе культивируемых соматических клеток различного происхождения. Системы всех трех типов могут быть использованы с одинаковым успехом для трансляции разнообразных мРНК и, как правило, не обнаруживают видоспецифичности. Ретикулоциты - безъядерные предшественники эритроцитов человека и животных, они осуществляют активный синтез гемоглобина и обладают всеми необходимыми компонентами белкового синтеза. Отсутствие у них ядер дает возможность получать бесклеточные экстракты, минимально загрязненные геномной ДНК. Бесклеточные системы на основе зародышей пшеницы содержат экстракт, выделяемый из сухих зерен озимой пшеницы. Возможность длительного хранения и доступность этого биологического материала обеспечивает хорошую воспроизводимость получаемых результатов Несмотря на то, что различные эукариотические бесклеточные белоксинтезирующие системы активно транслируют гетерологичные мРНК, гомологичные матрицы, как правило, транслируются более эффективно. Например, глобиновые мРНК транслируются на порядок лучше лизатами ретикулоцитов, чем экстрактами культивируемых клеток яичников китайских хомячков.
Кроме того, в клетках разных типов дифференцированных тканей могут присутствовать специфические белковые ингибиторы трансляции определенных мРНК.
Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. В каком виде можно экспрессировать целевые белки?
2. Какие системы экспрессии Вы знаете?
3. В чем преимущества и недостатки бактериальной системы экспресии в E.coli?
4. Что такое бесклеточная система экспресии?
5. Для чего в бесклеточную систему экспресии добавляют клеточный экстракт?
6. Можно ли создать "чистую" бесклеточную систему, содержащую только изолированные и очищенные компоненты белок-синтезирующей машины?
5. Экспрессия генов и препаративное получение целевых белков в практической Каждый способ экспресии гена обладает своими достоинствами и недостатками и конкретный выбор системы экспресии, очевидно, зависит от задачи, т.
е. свойств белка, который нам надо получить. При этом требования к системе экспрессии, по сути, одни и те же: стабильность (воспроизводимость), высокий выход продукта, простота выделения, правильная пространственная структура. Отсутствие правильной структуры у экспрессируемого белка может приводить к его деградации и, как следствие, невысокому выходу продукта. Или можно будет получить достаточные количества белка в виде телец включения, но ренатурировать такой белок удается далеко не всегда. То есть синтезированный полипептид имеет правильную первичную структуру (что легко проверяется секвенированием гена), которая, однако, не может сложиться в нативную функционирующую пространственную. Понятно, что такой белок, нам не нужен и необходимо добиваться получения правильно сложенного белка. Именно этот этап – создание эффективной системы экспресии и получение нативного белка часто является ключевым в работе белкового инженера. Весьма характерна ситуация, когда длительное время не удается создать такую систему для какого-либо редкого и сложного белка и его исследование осуществляется очень медленно на тех небольших количествах препарата, которые удается наработать из природного источника (например, яда змеи). Но, как только получена эффективная система экспрессии, белок немедленно выделяется в больших количествах, идет его интенсивное изучение, расшифровывается структура, становится возможным исследовать структурно-функциональные отношения в молекуле белка с помощью направленного мутагенеза. В результате за короткий срок мы узнаем об этом объекте гораздо больше, чем за многие предыдущие годы, когда в руках исследователей были лишь микроколичества природного материала. В качестве конкретного примера рассмотрим нейротоксин II – белок из яда кобры Naja oxiana, для которого длительное время не удавалось получить эффективную систему экспрессии. Как только же эта задача была решена - не без участия сотрудников кафедры биоинженерии - исследования нейротоксина вышли на качественно новый уровень.Рис. 7. Пространственная структура нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana На рисунке 7 показана его структура – это очень интересный небольшой белок с 4мя дисульфидными связями (именно эти дисульфидные связи и были камнем преткновения при его экспрессии). Нейротоксин II специфически взаимодействует с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами, встроенными в клеточную мембрану, которые играют роль в возникновении и развитии целого ряда болезней нервной системы (болезни Альцгеймера, эпилепсии, шизофрении и др.), а также в возникновении никотиновой зависимости у курильщиков. Понятно, что возможность блокирования и регулировки таких рецепторов имеет очень большое научно-практическое значение. Нейротоксин II был впервые описан более 20 лет тому назад, но работы с ним шли медленно в связи с тем, что белок длительное время удавалось получать только из яда змей в очень ограниченных количествах.
Рекомбинантный же белок получить не удавалось - при прямой экспрессии он был неактивен, так как наличие четырех дисульфидных связей на такой небольшой белок приводили к его неправильному сворачиванию в цитоплазме. В случае же гибридной экспрессии с тиоредоксином удавалось получать доли миллиграмма с литра культуры, причем процесс выделения и очистки был очень длительным и трудоемким. Задачу удалось решить лишь путем использования системы экспрессии с секрецией целевого белка, причем ключевым моментом в данном случае был подбор правильной лидерной (сигнальной) последовательности, наличие которой в полипептидной цепи приводит к секреции продукта.
также была найдена очень простая методика выделения этого белка, основанная на его высокой термостабильности. Дело в том, что нейротоксин выдерживает нагревание до градусов по Цельсию в растворе, в то время как большинство других белков при такой температуре денатурируют и выпадают в осадок. Поэтому одним из ключевых и самых эффективных этапов очистки белка оказался прогрев раствора, содержащего клеточные белки, при температуре 70 градусов с последующим центрифугированием. После этого в супернатанте оставался уже довольно чистый нейротоксин. В результате использования этой системы экспрессии был получен выход на бедной среде до ~15 мг/л, на богатой ~150 мг с литра культуры, то есть на порядок больше того, что было достигнуто другими исследователями. Понятно, что такая экспрессия вывела работу с нейротоксином на качественно новый уровень - стало возможным получать и исследовать различные мутанты этого белка, ставить и решать новые интересные задачи, о которых стоит здесь рассказать.
Проверка правильности структуры нейротоксина II (и чистоты полученного продукта) была выполнена с помощью спектроскопии ЯМР. Путем культивирования штамма-продуцента нейротоксина на среде, содержащей N15 меченый хлористый аммоний, удалось добиться того, что все азоты в белке были не обычные N14, а изотопы N15. Они показаны на рисунке 8 слева синими кружочками.
Рис. 8. Слева молекула нейротоксина, меченнного N15 (синие кружочки), справа – спектр ЯМР, Был получен спектр ЯМР с корреляцией химических сдвигов ядер N15 и протонов и проведено отнесение сигналов, которое показало, что сигналы всех ядер N15 белка присутствуют в этом спектре, их положение соответствует спектру нативного белка и в спектре отсутствуют сигналы от каких-либо примесей. Количественный анализ позволил сказать, что, по крайней мере 99% присутствующего в образце белка соответствует искомому продукту. Конечно, была проверена также биологическая активность генноинженерного белка и она совпала с активностью токсина, выделенного из яда змеи. Таким образом, использование секреции и выращивания белка в среде, содержащей N15, позволило нам получить желаемый продукт в больших количествах и использовать его для дальнейшего изучения ставить задачи по мутагенезу нейротоксина, которые были совершенно невозможны без такой системы экспрессии. Вот одна из этих задач.
Известно, что -нейротоксины змеиного яда делятся на два класса: короткие нейротоксины и длинные нейротоксины с дополнительной дисульфидной связью на кончике центральной петли (рисунок 9). Длинные и короткие токсины проявляют различную избирательность по отношению к никотиновым ацетилхолиновым рецепторам (нАХР). С рецепторами мускульного типа (то есть, имеющимися на поверности мышечных клеток) одинаково хорошо взаимодействуют токсины обоих типов, в то время как с рецепторами нейронального типа, находящимися на нейронах, эффективно взаимодействуют только длинные токсины. Сравнительный анализ структур -нейротоксинов позволил предположить, что ключевую роль в специфичности распознавания того или иного типа рецепторов играет, по-видимому, центральная петля молекулы -нейротоксинов.
Рис. 9. Сравнение пространственных структур нейротоксинов. Зеленым цветом показана центральная петля нейротоксина I с доплнительной дисульфидной связью (желтая линия).
Выяснилось, что эта петля похожа по своим структурным параметрам на короткие молекулы альфа-конотоксинов, которые хорошо связываются с рецепторами.
Было решено попробовать изменить специфичность нейротоксина II. С помощью метода сайт-направленного мутагенеза в молекулу короткого нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana был пересажен фрагмент центральной петли длинного нейротоксина I из яда этой кобры, и был получен мутантный вариант нейротоксина II c модифицированной центральной петлей, содержащей пятую дисульфидную связь. Проведенные исследования биологической активности рекомбинантного белка показали, что модифицированный нейротоксин II обладает сходной с нейротоксином I активностью по отношению к нейрональному никотиновому ацетилхолиновому рецептору, то есть, фактически, теми же самыми значениями Kd, что и исходный родительский белок, Таким образом, в результате этой работы нам удалось привить короткому нейротоксину из яда кобры способность эффективно взаимодействовать с нАХР нейронального типа. При этом существенно, что ключевым моментом, позволившим поставить и решить эту задачу, было получение эффективной системы экспрессии. Ведь мутанты часто экспрессируются заметно хуже, чем нативный белок (так было и в этом случае), поэтому без хорошей системы экспрессии просто не удалось бы наработать необходимые количества этих белков для их исследования. Изучение структуры нейротоксина методом ЯМР поставило очередные новые задачи для белковой инженерии этого белка. Было показано (с помощью метода гетероядерной спектроскопии), что при взаимодействии нейротоксина II с нАХР первая петля нейротоксина взаимодействует также и с поверхностью модельных липидных бицелл, состоящих из смеси двух детергентов, DMPC и DHPC и образующих аналог фосфолипидного бислоя клеточной мембраны. По-видимому, процесс блокировки канала нАХР происходит следующим образом: нейротоксин сначала садится на мембрану постсинаптической клетки, затем, диффундируя по мембране, находит рецептор, и происходит ингибирование рецептора токсином. Как можно подтвердить эту гипотезу? Очевидно, с помощью мутагенеза остатков, участвующих во взаимодействии с липидным окружением рецептора - изучая влияние мутаций в этих положениях на взаимодействие с рецептором в природном окружении и на взаимодействие с модельными мембранами. То есть здесь мы видим, как новые возможности белковой инженерии позволяют решать новые задачи, которые, в свою очередь ставят другие вопросы, для решения которых опять-таки нужна белковая инженерия.
Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. Какими свойствами должна обладать эффективная система экспрессии с точки зрения белкового инженера?
2. Означает ли получение полипептидного продукта с правильной первичной структурой решение задачи создания эффективной системы экспрессии?
3. В чем особенности нейротоксина II как объекта для препаративной гетерологичной экспрессии?
4. Как можно изменить специфичность взаимодействия нейротоксина с рецептором?
5. Какой из физико-химических методов исследования белковых молекул способен предоставить наибольшую информацию о молекуле белка в растворе?
Генно-инженерные белки, экспрессируемые в гетерологичных системах, часто не могут приобрести в клетке-хозяине или бесклеточной системе правильную пространственную структуру, обладающую биологической активностью. При этом белок может находиться в растворимом виде, но не иметь правильной структуры, или же образовывать нерастворимые агрегаты – тельца включения. Для того, чтобы привести такие белки в нативное состояние, необходимо их ренатурировать, вначале переведя в растворимое состояние с помощью сильных растворителей, а затем, постепенно убирая растворители, создать условия для правильного сворачивания белка. Ренатурация - это не простой, одноэтапный процесс, часто это достаточно нестандартная задача, не имеющая быстрого решения. Рассмотрим более подробно ренатурацию рекомбинантных белков из телец включения, образуемых при экспресии гетерологичных белков в E.coli. Тельца включения представляют собой частицы, состоящие, в основном, из агрегатов рекомбинантного белка, однако, они могут включать в себя также некоторое количество собственных бактериальных белков, "захваченных" чужеродным белком. Рекомбинантные белки в тельцах включения находятся в денатурированном неактивном состоянии, и для их получения в растворимом виде приходится применять мощные денатурирующие агенты, такие как мочевина, гуанидингидрохлорид и детергенты. Солюбилизированный в этих жестких условиях рекомбинантный белок для восстановления нативной конформации требует дальнейшей ренатурации, и поэтому задачей солюбилизации является не только получение мономолекулярного раствора белка, но и минимизация неприродных внутри- и межбелковых взаимодействий. Выбор солюбилизирующего агента (мочевина, гуанидинхлорид, детергенты и т.д.) определяет не только эффективность растворения телец, но и структуру денатурированного белка в растворе, а, значит, и пути его дальнейшей ренатурации.
Ренатурацию обычно индуцируют, снижая концентрацию денатурирующего агента. При этом процесс образования нативной пространственной структуры белка может сопровождаться и неправильным сворачиванием белка или агрегацией, которые ведут к получению неактивного белка. Соотношение этих процессов – "правильного" и "неправильного" – во многом зависит от процедуры снижения концентрации денатуранта и от свойств растворителя. Большие возможности открывает применение специальных добавок, осмолитов и химических шаперонов, которые стабилизируют правильно сложенные белки и облегчают процесс ренатурации. Получение белка из телец включения можно разделить на две фазы: растворение телец и последующая ренатурация белка.
Наиболее часто для растворении телец включения используются мочевина, гуанидингидрохлорид и сильные ионные детергенты, такие, например, как Nлаурилсаркозин. Растворение в мочевине и в гуанидинхлориде приводит к появлению неупорядоченной лабильной структуры белков, в то время, как структура белков в растворе детергента может быть самой различной. Известно, например, что комплексы белков с SDS содержат большое количество альфа-спиралей. Ионные детергенты являются наиболее сильными растворителями, в которых вероятность образования агрегатов минимальна. В тоже время сохранение структуры белка в комплексе с детергентом повышает вероятность образования внутрибелковых дисульфидных связей, как нативных, так и «неправильных», неприродных. Эффективность растворения и разворачивания белков в присутствии мочевины и гуанидинхлорида зависит от их концентрации. В большинстве случаев оптимально использовать 6-8 М мочевину и 6-7 М гуанидинхлорид, однако, даже при более высоких концентрациях в белке могут сохраняться некоторые меж- и внутримолекулярные взаимодействия, и эти взаимодействия могут вести к образованию неправильных структур и агрегатов при последующем элиминировании денатуранта. Необходимо отметить, что природные дисульфидные связи могут образовываться даже в развернутых белках в присутствии денатурантов, так как природная структура белка термодинамически наиболее выгодна. Для более эффективной ренатурации белка можно использовать промежуточные концентрации денатурантов (мочевины и гуанидингидрохлорида), при которых их связывание с белками ослаблено. Этот прием невозможен в случае детергентов, так как их связывание с белком определяется критической концентрацией мицеллообразования (ККМ), то есть такой концентрацией детергента, при которой он начинает образовывать мицеллы, на поверхность которых встаивается развернутый белок. Эффективное растворение белков происходит лишь при концентрации выше ККМ. Это означает, что ренатурация белка должна происходить в присутствии детергента. При убирании детергента еще не свернувшийся денатурированный белок, как правило, выпадает в осадок.
Ренатурация - это процесс сварачивания развернутой молекулы белка в правильную природную, биологически активную конформацию. Растворенные из телец включения белки не могут свернуться при высоких концентрациях денатурантов, они сольватированы и очень подвижны. Напротив, в водных растворах белки свернуты и компактны. В идеальных случаях перевод молекулов белка из денатурующих растворов в водный раствор должен приводить к сворачиванию. Однако, при быстром снижении концентрации денатурантов белки, как правило, образуют компактные, но неправильно сложенные структуры, склонные опять к агрегации. В этом случае белок утрачивает подвижность, что затрудняет возможность дисаггрегации и складывания нативной структуры. Ренатурация белка требует длительного присутствия промежуточных концентраций денатуранта, при которых белок еще сохраняет растворимость и подвижность, но уже склонен к сворачиванию. Исследования равновесных процессов ренатурации показали, что важную роль играют образующиеся в присутствии денатурантов промежуточные состояния белка. Эти структуры нестабильны и успешная ренатурация требует их перехода в нативную структуру при одновременном поддержании растворимости и подвижности. Дисульфид-содержащие белки, в принципе, могут складываться даже при высоких концентрациях денатуранта, если условия инкубации способствуют образованию дисульфидных связей. Однако, для ускорения образования и повышения вероятности формирования «правильных» связей все же необходим подбор оптимальной промежуточной концентрации денатуранта. Даже получение «правильных»
дисульфидных связей еще не гарантирует образование нативной структуры белка при элиминировании денатуранта. В этом случае определяющим является баланс между подвижностью белка и стабильностью нативной структуры. Поиск оптимального режима ренатурации начинается с выбора метода снижения концентрации денатуранта. Используют два способа снижения концентрации денатуранта в растворе: диализ и гель фильтрация.
Метод диализа основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором.
После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке будет тот же, что и в окружающем растворе. Наиболее простым подходом служит одностадийный диализ. В этом случае белок продолжительное время оказывается в растворе с промежуточной концентрацией денатуранта, которая медленно снижается. Этот подход прменяется для белков, которые сохраняют растворимость в развернутом или промежуточном состояниях. Важно, что при диализе концентрация белка остается практически постоянной, если не считать небольшого повышения объема за счет высокой осмолярности мочевины и гуанидина. Это означает, что ход ренатурации может критически зависеть от исходной концентрации белка. В некоторых случаях (например, при ренатурации антител) применяется ступенчатый диализ. При этом на каждом шаге устанавливается равновесие белка с определенной промежуточной концентрацией денатуранта.
Преимущества этого подхода проявляются в случае белков с дисульфидными связями, а также мультидоменных белков. Одним из вариантов этого метода является диализ против раствора с переменной концентрацией денатуранта. В этом случае диализный раствор исходно содержит высокую концентрацию денатуранта, которую затем постепенно снижают.
При быстром снижении эта методика близка к одностадийному диализу, а при медленном – к многосупенчатому.
При гель-фильтрации для того, чтобы освободиться от денатурантов, раствор денатурированного белка наносят на колонку, уравновешенную с буфером для ренатурации.
Использование колонок с крупнопористым гелем позволяет быстро отделить ренатурант, не фракционируя белки. Колонки с мелкопористым гелем могут обеспечить одновременное фракционирование белков по размеру. В обоих случаях постепенное снижение концентрации денатуранта происходит так же, как и при одностадийном диализе. Проблемы, связанные с соотношением скоростей убирания денатуранта и сворачивания белков, совпадают при обоих подходах. Различия определяются эффектами гелевого матрикса колонки на ренатурацию белков. Матрикс может взаимодействовать с белком благодаря гидрофобным взаимодействиям или образуя водородные связи при промежуточных концентрациях денатуранта и, таким образом препятствовать неправильному сворачиванию и агрегации.
Матрикс может так же способствовать дисперсии белков, уменьшая их агрегацию. Такой подход был, например, успешно использован для ренатурации интерлейкина-6 из раствора гуанидинхлорида. В этом случае белок был окислен в присутствии денатуранта, что привело к образованию правильных дисульфидных связей, а затем гуанидин был удален на колонке с Сефадексом G-25. Только после этого наблюдалась ренатурация активного белка.
Концентрацию денатуранта можно быстро понизить и простейшим образом, разведя образец в большом объеме буфера для ренатурации. При этом практически не возникает промежуточных концентраций денатуранта. При быстром разведении с большой вероятностью образуются компактные белковые структуры с низкой подвижностью, что ограничивает возможность флуктуаций и перестроек с образованием нативной структуры.
Для снижения этого эффекта рекомендуется добавка небольших концентраций денатуранта в раствор для ренатурации. Значение этой концентрации определяется стабильностью свернутого белка. В случае олигомерных белков проблемы могут возникать из-за низкой концентрации мономерных ренатурированных белков на ранних стадиях разведения. Чтобы обеспечить возможность олигомеризации возможно ускорить процедуру разведения.
Особым случаем разведения является «обратное разведение», когда буфер для ренатурации добавляется в раствор денатурированного белка. При этом концентрации белка и денатуранта снижаются одновременно. В этом случае высокая концентрация белка сохраняется при промежуточных концентрациях денатуранта, что может приводить к агрегации. С другой стороны, если промежуточные состояния белка сохраняют растворимость при промежуточных концентрациях денатуранта, то этот протокол оказывается предпочтительнее, так как дает белку время для медленных перестроек и сворачивания. Другой способ разведения основан на смешивании растворов белка и ренатурирующего буфера при определенном соотношении объемов. В течение этой процедуры концентрации белка и денатуранта остаются постоянными, в отличие от методик прямого и обратного разведения. Ход сворачивания белка и возникающие проблемы практически совпадают с теми, что характерны для прямого разведения. Если для предотвращения агрегации необходимо поддержание низкой концентрации денатурированного белка, то рекомендуется процедура прерывистого разведения. После добавления аликвоты денатурированного белка в раствор для ренатурации необходимо сделать паузу перед добавлением следующей аликвоты. Этот подход дает преимущество лишь в том случае, если свернутый белок не агрегирует в несвернутой или промежуточной формах.
Ренатурация белка может происходить с большей эффективностью, если он связан с аффинным матриксом (напр. Ni-содержащим носителем) или ионно-обменной смолой.
Связывание белка при этом происходит в присутствии денатуранта, который затем удаляют, промывая колонку. Эта процедура минимизирует опасность агрегации как развернутой, так и промежуточных форм белка. Главным недостатком этого метода являются стерические препятствия, возникающие при сворачивании белка, связанного с матриксом, в особенности, если это связывание является многоточечным. Эти проблемы можно частично преодолеть, если проводить ренатурацию в условиях частичной диссоциации, когда происходят флуктуации между связанным и свободным состоянием белка в процессе сворачивания.
Различные низкомолекулярные вещества могут ускорять процесс ренатурации белка.
Эти вещества могут быть разбиты на две группы: усиливающие сворачивание белка и препятствующие его агрегации. Эти два типа веществ могут оказывать отчасти противоположное действие. Усиление сворачивания белка, как правило, означает усиление белок-белковых взаимодействий, что может усилить агрегацию. Вещества, подавляющие агрегацию, должны преимущественно взаимодействовать с промежуточными формами белков, не влияя на процесс сворачивания. Этим требованиям удовлетворяют полиэтиленгликоль, циклодекстрин, аргинин хлорид и пролин. Полиэтиленгликоль и циклодекстрин, по-видимому, связываются с гидрофобными участками промежуточных форм белка, предотвращая их агрегацию. Наиболее часто на практике используется аргинин, но механизм его действия не до конца ясен. Показано, что аргинин не стабилизирует структуру белков и не усиливает сворачивание, но предотвращает агрегацию в процессе ренатурации. Известно, что многие низкомолекулярные заряженные вещества повышают стабильность белков и усиливают их способность к сворачиванию. К таким веществам относятся сахара, полиспирты, некоторые соли (такие, как сульфат аммония и хлорид магния), а так же некоторые аминокислоты (такие, как глицин и аланин). Одновременно они увеличивают компактность структуры и снижают подвижность белка. Понижение подвижности белка в присутствии таких стабилизаторов (например, сахарозы) было прямо показано с помощью методов изотопного обмена. В присутствии стабилизаторов, однако, увеличивается вероятность образования неправильно свернутых белков и агрегации. Их использование может дать преимущество, если денатурированные и промежуточные формы белка сохраняют растворимость и требуется значительное время для их правильного сворачивания. Так например, показано, что aльфа-синуклеин растворим в денатурированной форме и эффективность ренатурации повышается в присутствии стабилизатора триметиламин-N-оксида.
Иногда для борьбы с неправильным сворачиванием и агрегацией рекомбинантных белков белковым инженерам приходится изменять их первичную структуру, убирая "мешающие" аминокислотные остатки. В качестве примера такой задачи можно привести выполненную на нашей кафедре работу по модификации ингибитора рибонуклеазы барстара. Здесь, правда, нужно было устранить не грубую агрегацию продукта, а тонкую специфическую ассоциацию – образование димеров. Барстар – это небольшой белок (~ кДа), который, как оказалось относительно несложно получать – хороший уровень экспрессии, простая схема выделения и очистки. Но проблема возникла на другом этапе выяснилось, что правильно сложенный нативный барстар начинает димеризоваться в тех концентрациях, которые необходимы для проведения физико-химических исследований его структуры и динамики. Методом ЯМР были найдены константа димеризации, скорости образования и распада димера, а также выявлен участок димеризации. И тогда появилась идея изменить барстар - так, чтобы убрать эту димеризацию, не изменив при этом основные свойства белка. Т.е. была поставлена задача провести рациональный сайт-направленый мутагенез барстара с тем, чтобы уменьшить его склонность к димеризации, сохранив при этом пространственную структуру белка и его функцию (ингибитор рибонуклеазы). Анализ структуры димера показал, что белок димеризуется путем образования антипараллельной – структуры за счет гидрофобных взаимодействий между боковыми цепями остатков изолейцинов 86 и 87 и лейцина 88. Для решения задачи необходимо было нарушить межбелковые взаимодействия и сохранить взаимодействие внутри мономера. Анализ различных замен на интерфейсе димеризации методами молекулярного моделирования дал несколько возможных вариантов. Однако при экспрессии генов этих мутантов возникла другая проблема: такой белок перестал экспрессироваться! Почему? Возникло предположение, что это объясняется меньшей устойчивостью мутантов к внутриклеточным протеазам. А если так, то можно попытаться сохранить продукт, "прилепив" его к белкуносителю, т.е. путем гибридной экспрессии. Гибрид тиоредоксина и барстара был успешно получен, расщеплен энтерокиназой, и в результате был получен мутант изолейцин–87глутаминовая кислота, который сохранил структуру нативного белка, не димеризуется, стабилен и сохранил также свою функцию – образует прочный комплекс с рибонуклеазой барназой.
Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. В каких случаях необходимо ренатурировать рекомбинантные белки?
2. Что такое тельца включения?
3. Какие основные этапы включает процесс ренатурации рекомбинантного белка?
4. Почему нужно использовать сильные денатурирующие агенты?
5. Можно ли получить нативный белок в процессе ренатурации, не разрывая дисульфидных связей белка?
6. Каким образом можно понизить концентрацию денатуранта в процессе ренатурации рекомбинантного белка?
7. Искусственные белки с заданными свойствами.
Введение биологической активности в искусственные белки Конструирование искусственных белков или белков de novo, то есть абсолютно новых белковых конструкций с заданными свойствами – одна из наиболее амбициозных задач белковой инженерии. Очевидно, что полное понимание принципов построения структуры белков и ее связи с биологическими функциями белковых молекул подразумевает возможность создавать новые белки, и, в том числе, такие белки, которых нет (или они еще не обнаружены) в природе. Рассмотрим задачу создания искусственных белков на конкретном примере работы сотрудников нашей кафедры – конструирование искусственного белка альбебетина с заданной пространственной структурой и его биологически активных производных.
К настоящему времени в мире проведен дизайн десятков структур белков de novo, для части из них были химически синтезированы гены и эти белки удалось получить и исследовать. Практически все такие белки основывались на повторении природных белковых структур и, зачастую, на прямом использовании элементов их аминокислотных последовательностей. В то же время современная теория белковых структур, созданная в нашей стране О.Б.Птицыным и его школой, в принципе позволяет конструировать белки и с новой, то есть не обнаруженной до сих пор в природе архитектурой. Именно одна из таких белковых структур, показанная на рисунке 10, была выбрана для дизайна первого искусственного белка с новой архитектурой. Эта структура отвечает всем известным принципам формирования структуры глобулярных белков, в то же время в природных белках она не встречалась. Этот белок был назван альбебетином, так как он состоит из двух повторяющихся элементов альфа-бета-бета.
«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурский государственный университет Кафедра Конструирования и технологии одежды УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ Системы конструирования одежды Основной образовательной программы по специальности 260902.65 Конструирование швейных изделий Благовещенск 2012 УМКД разработан доцентом кафедры Конструирования и технологии одежды Киселевой...»
«Оглавление Затраты времени обучающегося на изучение дисциплины Введение..3 1. Цель и задачи дисциплины..3 2. Место дисциплины в учебном процессе специальности.4 3. Перечень и содержание дисциплины. Лекционный курс.5 4. Перечень практических занятий.10 5. Перечень лабораторных работ..10 6. Учебно-методические материалы по дисциплине.11 7. Карта обеспеченности учебно-методической литературой.12 Приложение 1 Экзаменационные вопросы Приложение 2 Задание на курсовую работу Приложение 3 Методические...»
«Пояснительная записка Рабочая программа по географии составлена в соответствии с федеральным компонентом государственного стандарта общего образования, одобренный совместным решением коллегии Минобразования России и Президиума РАО от 23.12.2003 г. № 21/12 и утвержденный приказом Минобрнауки РФ от 05.03.2004 г. № 1089, инструктивно-методического письма О преподавании предмета География в общеобразовательных учреждениях Белгородской области в 2013-2014 учебном году. Примерная структура рабочей...»
«ЦЕНТР СОДЕЙСТВИЯ КОРЕННЫМ МАЛОЧИСЛЕННЫМ НАРОДАМ СЕВЕРА Н.В. Моралева, Е.Ю. Ледовских, Т. Келер, Д.В. Киричевский, М.Ю. Рубцова, В.П. Чижова АБОРИГЕННЫЙ ЭКОТУРИЗМ МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ Россия 2008 Ассоциация коренных малочисленных народов Центр содействия Севера, Сибири и Дальнего Востока коренным малочисленным народам Севера Российской Федерации ЦС КМНС АКМНССДВ РФ 119415, Москва, а/я 119415, Москва, а/я [email protected] [email protected] www.csipn.ru www.raipon.org Моралева Н.В., Ледовских Е.Ю.,...»
«УРАВНЕНИЯ ЛАГРАНЖА II РОДА Публикуется по учебному изданию Уравнения Лагранжа второго рода: методические указания к курсовому заданию по динамике / В.И.Дронг, Г.М.Максимов, А.И.Огурцов / под ред. В.В.Дубинина. – М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э.Баумана, 1985. _ 1. Груз 1 массой m1 скользит по наклонной плоскости, образующей угол с горизонтом. К грузу прикреплен конец нерастяжимой нити, которая переброшена через блок 4 и намотана на барабан 3 радиуса r, жестко соединенный с катком 2 радиуса R. Каток 2...»
«Министерство образования Российской Федерации _ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ НЕФТИ И ГАЗА им. И.М. ГУБКИНА КАФЕДРА АВТОМАТИЗАЦИИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Е.Н. БРАГО, О.В. ЕРМОЛКИН Новые информационные технологии и измерительное оборудование контроля дебита скважин. Методические указания к практическим занятиям по дисциплине ИЗМЕРЕНИЕ И КОНТРОЛЬ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НЕФТЕГАЗОВЫХ ПРОИЗВОДСТВ Москва 2004 УДК 681.518+681.2:622.276. Браго Е.Н., Ермолкин О.В. Новые информационные...»
«Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Факультет вычислительной математики и кибернетики Волкова И.А. Введение в компьютерную лингвистику. Практические аспекты создания лингвистических процессоров (Учебное пособие для студентов факультета ВМиК МГУ) Москва 2006 УДК 519.6+681.3.06 Данное учебное пособие разработано в поддержку спецкурса Компьютерная лингвистика, читаемого на факультете ВМиК для студентов 3-5 курсов. Приводятся подробные пояснения и рекомендации. Рецензенты:...»
«Утверждена Приказом Министерства образования и науки Российской Федерации от 3 сентября 2009 г. N 323 (в ред. Приказа Минобрнауки РФ от 07.06.2010 N 588) СПРАВКА о наличии учебной, учебно-методической литературы и иных библиотечно-информационных ресурсов и средств обеспечения образовательного процесса, необходимых для реализации заявленных к лицензированию образовательных программ Раздел 2. Обеспечение образовательного процесса учебной и учебно-методической литературой по заявленным к...»
«Методические указания по внедрению и применению Санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.559-96 Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества (утв. Главным государственным санитарным врачом от 20 декабря 1997 г.) МУ 2.1.4.682-97 Дата введения: с 1 января 1998 года См. также Методические рекомендации по обеспечению выполнения требований санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.559-96 Питьевая вода. Гигиенические требования к...»
«Организация работы по составлению предисловия к описи дел фондов, хранящихся в государственных, муниципальных и ведомственных архивах (методическое письмо) Информационно-методический бюллетень N 18 за 2002 г. от 01.06.2002 стр. 46 _ Лист l Организация работы по составлению предисловия к описи дел фондов, хранящихся в государственных,. муниципальных и ведомственных архивах (методическое письмо) Сорокина B.C. начальник отдела управления по делам архивов Правительства Хабаровского края Святенькая...»
«Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й КОМИТЕТ СССР ПО Н А Р О Д Н О М У О Б Р А З О В А Н И Ю УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ О Б Ъ Е Д И Н Е Н И Е ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИЧЕСКИХ СПЕЦИАЛЬНОСТЕЙ / Ленинградский гидрометеорологический институт Одесский гидрометеорологический институт СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ ПРОГНОЗЫ ПОГОДЫ Утверждено Ученым советом института в качестве учебного пособия ЛЕНИНГРАД 1991 У Д К 551.509.34 - ^,. Специализированные прогнозы погоды. Учебное пособие; Л., изд. ЛГМИ, 1991, 112 с. И з л а г а ю т с я...»
«Уважаемые выпускники! В перечисленных ниже изданиях содержатся методические рекомендации, которые помогут должным образом подготовить, оформить и успешно защитить выпускную квалификационную работу. Рыжков, И. Б. Основы научных исследований и изобретательства [Электронный ресурс] : [учебное пособие для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки (специальностям) 280400 - Природообустройство, 280300 - Водные ресурсы и водопользование] / И. Б. Рыжков.- СанктПетербург [и др.] : Лань,...»
«MI,IH OFPHAYKIT POC CVTVI @e4epanbuo rocyAapcrBeHHoe e yqpex(AeHlre 6roANerHo o6pasonareJrbuoe e BbrcrrreroupoS eccr4 HElnburo o6pason auvrfl. o o (yxru Hc Krr fi rocyAa p crBeH Hbr fi TexH Hrrec Kr.r yH r{Bep curer) fi (yrry) "l$-,ffitfif,ID 6\hffiffi) p rro HayrrHofipa6ore oHHOfi AeflTenbHOCTH w{8* (("- B. E. Kyreuon 2011it|AP IIPOTPAMMA BCTyrrr4TenbH oro 3K3aMeHa B acrll4paHTypy n o cleqr4€urbHocTu 05.21.01 - TexsoJrorlrf, vrMarnr4Hbr Jreco3aroroBoK r4 JrecHofo xo3flficrsa IIo...»
«1 Количество названий/ сведения о грифах ВолгГТУ Вид литературы ВПИ КТИ Всего Плановые Заказные Учебная литература Учебники. 1/1 – – – 1/1 Учебные пособия. 67/19 7/3 14/14 31/5 119/41 Электронные аналоги печатных изданий. 26/0 – 40/0 – 66/0 Научная литература Известия ВолгГТУ. 12 3 – – 15 Сборники трудов научных конференций. 5 1 2 2 Монографии (ИУНЛ и др. изд-ва). 43 – 6 1 108 66 119 Учебно-методическая литература. СОДЕРЖАНИЕ Тематический план ВолгГТУ.. Учебная литература.. Научная...»
«(ПРОЕКТ, НЕ УТВЕРЖДЁН) МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОЦЕНКЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНВЕСТИЦИОННЫХ ПРОЕКТОВ _ (Третья редакция, исправленная и дополненная) Москва - 2008 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ (не утверждены, проект) Рекомендации разработаны авторским коллективом в составе: Руководители: В.В.Коссов, В.Н.Лившиц, А.Г.Шахназаров. Участники: Н.Г.Алешинская, П.Л.Виленский, И.А.Никонова, А.А.Первозванский, Г.П.Писчасов, Н.Я.Рябикова, С.А.Смоляк, В.П.Трофимов. 2 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ (не утверждены,...»
«Развертки комбинированных поверхностей вращения Методические указания для студентов направлений подготовки 262000 Технология изделий легкой промышленности, 262200 Конструирование изделий легкой промышленности Иваново 2012 Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ивановская государственная текстильная академия (ИГТА) Кафедра инженерной графики Развертки комбинированных поверхностей...»
«Санкт-Петербургский государственный университет Высшая школа менеджмента МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ПОДГОТОВКЕ КУРСОВЫХ РАБОТ ПО ПРОФИЛЮ ПОДГОТОВКИ НА БАКАЛАВРСКОЙ ПРОГРАММЕ ПО НАПРАВЛЕНИЮ 080500 – МЕНЕДЖМЕНТ Составители: доц. Баранов И.Н., доц. Зенкевич Н.А., доц. Федотов Ю.В. Печатается по решению учебно-методической комиссии Высшей школы менеджмента СПбГУ Санкт-Петербург 2009 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 1.1. Подготовка и защита курсовой работы по профилю подготовки (далее – курсовая работа) является...»
«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина Институт государственного управления и предпринимательства МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО НАПИСАНИЮ И ОФОРМЛЕНИЮ КОНТРОЛЬНЫХ И КУРСОВЫХ РАБОТ, ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ БАКАЛАВРА, ДИПЛОМНОГО ПРОЕКТА СПЕЦИАЛИСТА, МАГИСТЕРСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ Екатеринбург 2012...»
«Методические указания по ведению бюджетного учета и составлению бюджетной отчетности финансовых органов Содержание ВВЕДЕНИЕ 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 2. БЮДЖЕТНЫЙ УЧЕТ В ФИНАНСОВЫХ ОРГАНАХ 2.1. Учет средств на счетах бюджетов 2.1.1. Счет 0.202.00.000 Средства на счетах бюджетов. 2.1.2. Счет 0.202.01.000 Средства единого счета бюджета. 2.1.3. Счет 0.202.02.000 Средства бюджета в пути. 2.1.4. Счет 0.202.03.000 Средства бюджета в иностранной валюте.37 2.1.5. Отражение показателей остатков и оборотов по...»
Курсовая работа
по дисциплине: Сельскохозяйственная биотехнология
на тему: «Белковая инженерия»
Введение. Белковая инженерия
2 Стратегии белковой инженерии. Примеры инженерных белков. Применение белковой инженерии
1 Библиотеки пептидов и эпитопов
2 Белки-репортеры в гибридных белках
3 Некоторые достижения белковой инженерии.
Заключение
Список литературы
Реферат
Тема работы: Белковая инженерия.
Ключевые слова: биотехнология, генная инженерия, белок, генетический код, ген, ДНК, РНК, АТФ, пептиды, эпитоп.
Цель курсовой работы: изучение понятия «белковая инженерия» и потенциальных возможностей её использования.
Потенциальные возможности белковой инженерии:
Изменив прочность связывания преобразуемого вещества - субстрата - с ферментом, можно повысить общую каталитическую эффективность ферментативной реакции.
Повысив стабильность белка в широком диапазоне температур и кислотности среды, можно использовать его в условиях, при которых исходный белок денатурирует и теряет свою активность.
Создав белки, способные функционировать в безводных растворителях, можно осуществлять каталитические реакции в нефизиологических условиях.
Изменив каталитический центр фермента, можно повысить его специфичность и уменьшить число нежелательных побочных реакций
Повысив устойчивость белка к расщепляющим его ферментам, можно упростить процедуру его очистки.
Изменив белок таким образом, чтобы он мог функционировать без обычного для него не аминокислотного компонента (витамина, атома металла и т.п.), можно использовать его в некоторых непрерывных технологических процессах.
Изменив структуру регуляторных участков фермента, можно уменьшить степень его торможения продуктом ферментативной реакции по типу отрицательной обратной связи и тем самым увеличить выход продукта.
Можно создать гибридный белок, обладающий функциями двух и более белков.
Можно создать гибридный белок, один из участков которого облегчает
выход гибридного белка из культивируемой клетки или извлечение его из смеси.
Введение
С незапамятных времен биотехнология применялась преимущественно в пищевой и легкой промышленности: в виноделии, хлебопечении, сбраживании молочных продуктов, при обработке льна и кож, основанных на применении микроорганизмов. В последние десятилетия возможности биотехнологии необычайно расширились. Это связано с тем, что ее методы выгоднее обычных по той простой причине, что в живых организмах биохимические реакции, катализируемые ферментами, идут при оптимальных условиях (температуре и давлении), более производительны, экологически чисты и не требуют химических реактивов, отравляющих среду .
Объектами биотехнологии являются многочисленные представители групп живых организмов - микроорганизмы (вирусы, бактерии, простейшие, дрожжевые грибы), растения, животные, а также изолированные из них клетки и субклеточные компоненты (органеллы) и даже ферменты. Биотехнология базируется на протекающих в живых системах физиолого-биохимических процессах, в результате которых осуществляются выделение энергии, синтез и расщепление продуктов метаболизма, формирование химических и структурных компонентов клетки.
Главным направлением биотехнологии является производство с помощью микроорганизмов и культивируемых эукариотических клеток биологически активных соединений (ферменты, витамины, гормоны), лекарственных препаратов (антибиотики, вакцины, сыворотки, высокоспецифичные антитела и др.), а также ценных соединений (кормовые добавки, например, незаменимые аминокислоты, кормовые белки и т. д.).
Методы генетической инженерии позволили осуществить синтез в промышленных количествах таких гормонов, как инсулин и соматотропин (гормон роста), которые необходимы для лечения генетических болезней человека.
Биотехнология решает не только конкретные задачи науки и производства. У нее есть более глобальная методологическая задача - она расширяет и ускоряет масштабы воздействия человека на живую природу и способствует адаптации живых систем к условиям существования человека, т. е. к ноосфере. Биотехнология, таким образом, выступает в роли мощного фактора антропогенной адаптивной эволюции.
У биотехнологии, генетической и клеточной инженерии многообещающие перспективы. При появлении все новых и новых векторов человек с их помощью будет внедрять нужные гены в клетки растений, животных и человека. Это позволит постепенно избавиться от многих наследственных болезней человека, заставить клетки синтезировать необходимые лекарства и биологически активные соединения, а затем - непосредственно белки и незаменимые аминокислоты, употребляемые в пищу. Используя методы, уже освоенные природой, биотехнологи надеются получать с помощью фотосинтеза водород - самое экологически чистое топливо будущего, электроэнергию, превращать в аммиак атмосферный азот при обычных условиях .
Физические и химические свойства природных белков часто не удовлетворяют условиям, в которых эти белки будут использоваться человеком. Требуется изменение его первичной структуры, которое обеспечит формирование белка с иной, чем прежде, пространственной структурой и новыми физико-химическими свойствами, позволяющими и в иных условиях выполнять присущие природному белку функции. Конструированием белков занимается белковая инженерия .
Еще одной областью применения белковой инженерии является создание белков, способных нейтрализовать вещества и микроорганизмы, которые могут быть использованы для химических и биологических атак. Например, ферменты гидролазы способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в сельском хозяйстве пестициды. При этом производство, хранение и использование ферментов не опасно для окружающей среды и здоровья людей.
Для получения измененного белка используют методы комбинаторной химии и осуществляют направленный мутагенез - внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящие к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях. Для эффективного конструирования белка с заданными свойствами необходимо знать закономерности формирования пространственной структуры белка, от которой зависят его физико-химические свойства и функции, то есть необходимо знать, как первичная структура белка, каждый его аминокислотный остаток влияет на свойства и функции белка. К сожалению, для большинства белков неизвестна третичная структура, не всегда бывает известно, какую именно аминокислоту или последовательность аминокислот нужно изменить, чтобы получить белок с нужными свойствами. Уже сейчас ученые с помощью компьютерного анализа могут предсказывать свойства многих белков, исходя из последовательности их аминокислотных остатков. Подобный анализ значительно упростит процедуру создания нужных белков. Пока же для того, чтобы получить измененный белок с нужными свойствами, идут в основном иным путем: получают несколько мутантных генов и находят тот белковый продукт одного из них, который обладает нужными свойствами.
Для направленного мутагенеза используют разные экспериментальные подходы.
Получив измененный ген, его встраивают в генетическую конструкцию и вводят ее в
прокариотические или эукариотические клетки, осуществляющие синтез белка,
кодируемого этой генетической конструкцией .
I. Белковая инженерия
.1 Понятие белковой инженерии. История развития
Белковая инженерия (англ. Protein engineering) - раздел биотехнологии, который занимается разработкой полезных или ценных белков. Это относительно новая дисциплина, которая направлена на исследование фолдинга белков и принципов модификации и создания белков.
Существуют две основные стратегии для белковой инженерии: направленная модификация белка и направленная эволюция. Эти методы не являются взаимоисключающими; исследователи часто применяют оба. В будущем, более детальное знание структуры и функции белков, а также достижения в области высоких технологий, может значительно расширить возможности белковой инженерии. В итоге, даже неприродные аминокислоты могут быть включены благодаря новому методу, который позволяет включать новые аминокислоты в генетический код .
Белковая инженерия зародилась на стыке физики и химии белка и генетической инженерии. Она решает задачу создания модифицированных или гибридных молекул белков с заданными характеристиками. Естественным путем реализации такой задачи является предсказание структуры гена, кодирующего измененный белок, осуществление его синтеза, клонирования и экспрессии в реципиентных клетках .
Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы - субтилизина они применили метод химической модификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность.
Белок в химическом отношении представляет собой однотипную молекулу, которая является полиаминокислотной цепочкой или полимером. Составлен он из аминокислотных последовательностей 20 типов. Узнав строение белков, люди задались вопросом: можно ли спроектировать абсолютно новые аминокислотные последовательности, чтобы они выполняли нужные человеку функции гораздо лучше, чем обычные белки? Для данной идеи подошло название Белковая инженерия .
О такой инженерии стали задумываться ещё в 50-е годы XX столетия. Случилось это сразу же после расшифровки первых белковых аминокислотных последовательностей. Во многих лабораториях мира начали делать попытки дублировать природу и синтезировать химическим путём заданные абсолютно произвольно полиаминокислотные последовательности.
Больше всех в этом преуспел химик Б. Меррифилд. Этому американцу удалось
разработать чрезвычайно эффективный метод синтеза полиаминокислотных цепей. За
это Меррифилду в 1984 году присудили Нобелевскую премию по химии.
Рисунок 1. Схема функционирования белковой инженерии
Американец начал синтезировать короткие пептиды, включая гормоны. При этом построил автомат - «химического робота» - в задачу которого входило производит искусственные белки. Робот вызвал сенсацию в научных кругах. Однако скоро выяснилось, что его продукция не может конкурировать с тем, что производит природа.
Робот не мог в точности воспроизводить аминокислотные последовательности, то есть ошибался. Он синтезировал одну цепь с одной последовательностью, а другую уже с немного изменённой. В клетке же все молекулы одного белка идеально похожи друг на друга, то есть их последовательности абсолютно одинаковые.
Была и другая проблема. Даже те молекулы, которые робот синтезировал правильно, не принимали ту пространственную форму, которая необходима для функционирования фермента. Таким образом, попытка подменить природу обычными методами органической химии привела к весьма скромному успеху.
Учёным оставалось учиться у природы, выискивая нужные модификации белков. Тут дело в том, что в природе постоянно идут мутации, ведущие к изменению аминокислотных последовательностей белков. Если отобрать мутантов с необходимыми свойствами, более эффективно перерабатывающих тот или иной субстрат, то можно выделить из такого мутанта измененный фермент, благодаря которому клетка приобретает новые свойства. Но данный процесс занимает очень большой период времени.
Все изменилось тогда, когда появилась генная инженерия. Благодаря ей, стали создавать искусственные гены с любой последовательностью нуклеотидов. Эти гены встраивали в приготовленные молекулы-векторы и внедряли эти ДНК в бактерии или дрожжи. Там с искусственного гена снималась копия РНК. В результате этого вырабатывался нужный белок. Ошибки в его синтезе исключались. Главное, надо было подобрать нужную последовательность ДНК, а дальше уже ферментная система клетки сама безупречно делала своё дело. Таким образом, можно заключить, что генная инженерия открыла путь белковой инженерии в самой радикальной форме .
1.2 Стратегии белковой инженерии
Направленная модификация белка. При направленной модификации белка ученый использует детальное знание структуры и функции белка, чтобы внести нужные изменения. Как правило, этот метод имеет то преимущество, что он недорогой и технически несложный, так как техника сайт-направленного мутагенеза хорошо развита. Однако, его основным недостатком является то, что сведения о подробной структуре белка часто отсутствуют, и даже когда структура известна, может быть очень трудно предсказать влияние различных мутаций.
Программные алгоритмы модификации белка стремятся к выявлению новых аминокислотных последовательностей, которые требуют мало энергии для формирования предопределенной целевой структуры. В то время как последовательность, которая должно быть найдена, велика, наиболее сложным требованием для модификации белка является быстрый, но точный, способ для выявления и определения оптимальной последовательности, в отличие ее от аналогичных субоптимальных последовательностей .
Направленная эволюция. В направленной эволюции случайный мутагенез применяется к белку и селекция идет так, чтобы выбрать варианты, которые имеют определенные качества. Далее применяются еще раунды мутации и селекции. Этот метод имитирует естественную эволюцию и в целом позволяет получить превосходные результаты для направленной модификации.
Дополнительный метод, известный как ДНК-перетасовки, смешивает и выявляет
части удачных вариантов для получения лучших результатов. Этот процесс
имитирует рекомбинации, которые происходят естественно во время полового
размножения. Преимуществом направленной эволюции является то, что она не
требует предварительных знаний о структуре белка, да и не нужно, чтобы иметь
возможность прогнозировать, какое влияние данная мутация будет иметь. В самом
деле, результаты экспериментов направленной эволюции удивляют, поскольку
желаемые изменения часто бывают вызваны мутациями, которые не должны были иметь
такой эффект. Недостатком является то, что этот метод требует высокой
пропускной способности, который не представляется возможным для всех белков.
Большое количество рекомбинантной ДНК должно быть мутированным и необходимо
провести скрининг продуктов на выявление желаемого качества. Огромное
количество вариантов часто требует покупки робототехники для автоматизации
процесса. Кроме того, не всегда легко провести скрининг на выявление всех
интересующих качеств .
II. Примеры инженерных белков
Белковая инженерия может быть основана на химической модификации готового белка или на методах генетической инженерии, позволяющих получать модифицированные варианты природных белков .
Конструирование определенного биологического катализатора ведется с учетом как специфичности белка, так и каталитической активности металлоорганического комплекса. Вот примеры такой модификации, проведенной для получения «полусинтетических биоорганических комплексов». Миоглобин кашалота способен связывать кислород, но не обладает биокаталитической активностью. В результате объединения этой биомолекулы с тремя электрон-переносящими комплексами, содержащими рутений, которые связываются с остатками гистидина на поверхности молекул белка, образуется комплекс, способный восстанавливать кислород при одновременном окислении ряда органических субстратов, например аскорбата, со скоростью почти такой же, как для природной аскорбатоксидазы. В принципе белки можно модифицировать и другими способами. Рассмотрим, например, папаин. Он относится к числу хорошо изученных протеолитических ферментов, для которого определена трехмерная структура. Поблизости от остатка цистеина-25 на поверхности белковой молекулы располагается протяженный желобок, в котором протекает реакция протеолиза. Этот участок может быть алкилирован производным флавина без изменения доступности участка связывания потенциальных субстратов. Такие модифицированные флавопапаины использовались для окисления М-алкил-1,4-дигидроникотинамидов, и каталитическая активность некоторых из этих модифицированных белков была существенно выше, чем у природных флавопротеин-NADH-дегидрогеназ. Таким образом удалось создать очень эффективный полусинтетический фермент. Использование флавинов с высокоактивными, находящимися в определенном положении электрон-оттягивающими заместителями, возможно, позволит разработать эффективные катализаторы для восстановления никотин-амида.
Крупные успехи, достигнутые за последнее время в химическом синтезе ДНК, открыли перед белковой инженерией принципиально новые возможности: конструирование уникальных, не встречающихся в природе белков. Для этого необходимо и дальнейшее развитие технологии, так чтобы изменение генов методами генетической инженерии приводило к предсказуемым изменениям белков, к улучшению вполне определенных функциональных их характеристик: числа оборотов, Км для конкретного субстрата, термостабильности, температурного оптимума, стабильности и активности в неводных растворителях, субстратной и реакционной специфичности, потребности в кофакторах, оптимуме рН, устойчивости к протеазам, аллостерической регуляции, молекулярной массы и субъединичного строения. Обычно такого улучшения достигали с помощью мутагенеза и отбора, а в последнее время - путем химической модификации и иммобилизации. Для успешного конструирования конкретного типа молекул белка необходимо выявить ряд основополагающих закономерностей, связывающих структурные особенности белков и их желаемые свойства. Так, зная точную кристаллическую структуру молекулы изучаемого белка, можно идентифицировать те ее участки, которые следует направленно модифицировать для увеличения его каталитической активности. Такая модификация может состоять в изменении аминокислотной последовательности белка .
Ещё одним примером может служить осуществление сайт-специфического мутагенеза. Он происходит следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подходящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти - пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов.
Тирозил-тРНК-синтетаза катализирует реакцию аминоацилирования тирозиновой тРНК, которая включает активирование тирозина с помощью АТР с образованием тирозиладенилата. Ген этого фермента, выделенный из Bacillus stearothermophilus, был встроен в бактериофаг М13. Затем каталитические свойства фермента, особенно его способность связывать субстрат, были изменены путем сайт-специфической модификации. Так, треонин-51 был заменен на аланин. Это привело к двукратному увеличению связывания субстрата, видимо, из-за невозможности образования водородной связи между этим остатком и тирозил-аденилатом. При замене аланина пролином нарушается конфигурация молекулы фермента, но способность к связыванию субстрата увеличивается в сто раз, так как облегчается его взаимодействие с гистидином-48. Сходные сайт-специфичные изменения, были получены в р-лактамазе, и обычно они сопровождались инактивацией фермента. Замена серина-70 на цистеин приводит к образованию р-тиоллактамазы, константа связывания у которой не отличается от таковой для природного фермента, но активность по отношению к пенициллину составляет всего 1-2%. Тем не менее активность этого мутантного фермента в отношении некоторых активированных цефалоспоринов не меньше исходной активности или даже превышает ее; эти белки также более устойчивы к действию протеаз.
Мутации, вызываемые путем сайт-специфичного воздействия, используют
сегодня для проверки адекватности результатов структурных исследований. В
некоторых случаях с их помощью удалось показать, что структурная стабильность
белка и его каталитическая активность могут быть разобщены. Накопилось
достаточное количество информации о взаимосвязи между стабильностью структуры
белка и его функцией, мы, возможно, сумеем осуществлять тонкую регуляцию
активности биологических катализаторов и создавать полностью синтетические их
аналоги. Недавно появилась работа, в которой сообщалось о клонировании первого
синтетического гена фермента, кодирующего активный фрагмент молекулы
рибонуклеазы .
III. Применение белковой инженерии
Технология белковой инженерии используется (часто - в сочетании с методом рекомбинантных ДНК) для улучшения свойств существующих белков (ферментов, антител, клеточных рецепторов) и создания новых, не существующих в природе протеинов. Такие белки применяются для создания лекарственных препаратов, при обработке пищевых продуктов и в промышленном производстве .
Однако некоторые характеристики биокатализаторов делают их использование в ряде случаев неприемлемым. Например, большинство ферментов распадается при повышении температуры. Ученые пытаются преодолеть подобные препятствия и увеличить стабильность ферментов в суровых условиях производства с помощью методов белковой инженерии .
Кроме промышленного применения, белковая инженерия нашла себе достойное место и в медицинских разработках. Исследователи синтезируют белки, способные связываться с вирусами и мутантными генами, вызывающими опухоли, и обезвреживать их; создают высокоэффективные вакцины и изучают белки-рецепторы клеточной поверхности, которые часто являются мишенями для фармацевтических препаратов. Ученые, занимающиеся усовершенствованием продуктов питания, используют белковую инженерию для улучшения качеств белков, обеспечивающих сохранность продуктов растительного происхождения, а также желирующих веществ или загустителей.
Еще одной областью применения белковой инженерии является создание
белков, способных нейтрализовать вещества и микроорганизмы, которые могут быть
использованы для химических и биологических атак. Например, ферменты гидролазы
способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в
сельском хозяйстве пестициды. При этом производство, хранение и использование
ферментов не опасно для окружающей среды и здоровья людей .
3.1 Библиотеки пептидов и эпитопов
В живом организме большинство биологических процессов управляется посредством специфических белок-белковых или белково-нуклеиновых взаимодействий. К таким процессам относятся, например регуляция транскрипции генов под действием различных белковых факторов, взаимодействие белковых лигандов с рецепторами на поверхности клеток, а также специфическое связывание антигенов соответствующими антителами. Понимание молекулярных механизмов взаимодействия белковых лигандов с рецепторами имеет большое фундаментальное и прикладное значение. В частности, разработка новых лекарственных препаратов белковой природы обычно начинается с идентификации исходной последовательности аминокислот, обладающей требуемой биологической активностью (так называемая "основная" (lead) последовательность). Однако пептиды с основной последовательностью аминокислот могут обладать и нежелательными биологическими свойствами: низкой активностью, токсичностью, малой стабильностью в организме и т.п.
До появления библиотек пептидов улучшение их биологических свойств осуществляли путем последовательного синтеза большого числа аналогов и проверкой их биологической активности, что требовало больших затрат времени и средств. В последние годы появилась возможность с помощью автоматических синтезаторов создавать за короткое время тысячи различных пептидов. Разработанные методы направленного мутагенеза также позволили резко расширить число белков, получаемых одновременно и последовательно тестируемых на биологическую активность. Однако только недавно разработанные подходы к созданию библиотек пептидов привели к получению миллионов последовательностей аминокислот, требуемых для проведения эффективного скрининга с целью выявления среди них пептидов, максимально удовлетворяющих предъявляемым критериям. Такие библиотеки используются для исследования взаимодействия антител с антигенами, получения новых ингибиторов ферментов и антимикробных агентов, конструирования молекул, обладающих требуемой биологической активностью, или придания новых свойств белкам, например антителам .
По способам получения библиотеки пептидов разделяются на три группы. К первой группе можно отнести библиотеки, полученные с использованием химического синтеза пептидов, в которых индивидуальные пептиды иммобилизованы на микроносителях. При таком подходе после присоединения очередных аминокислот в индивидуальных реакционных смесях к пептидам, иммобилизованным на микроносителях, содержимое всех реакционных смесей объединяют и разделяют на новые порции, которые используют на следующей стадии присоединения новых аминокислотных остатков. После проведения ряда таких этапов оказываются синтезированными пептиды, содержащие последовательности использованных в синтезе аминокислот во всевозможных случайных сочетаниях.
Библиотеки пептидов, иммобилизованных на микроносителях, обладают существенным недостатком: они требуют при скрининге использования очищенных рецепторов, находящихся в растворимой форме. В то же время в большинстве случаев при биологических испытаниях, проводящихся для фундаментальных и фармакологических исследований, чаще всего находят применение рецепторы, ассоциированные с мембранами. По второму способу библиотеки пептидов получают с помощью твердофазного синтеза пептидов, при котором на каждой стадии химического присоединения очередной аминокислоты к растущим пептидным цепям используют эквимолярные смеси всех или некоторых аминокислот-предшественников. На конечной стадии синтеза проводят отделение пептидов от носителя, т.е. перевод их в растворимую форму. Третий подход к конструированию библиотек пептидов, к описанию которого мы сейчас переходим, стал реальным именно благодаря развитию методов генной инженерии. Он прекрасно иллюстрирует возможности таких методов и, несомненно, является крупным достижением в их применении. В этой связи рассмотрим более подробно результаты использования библиотек пептидов в исследовании эпитопов (антигенных детерминант) белков .
Генно-инженерная технология получения гибридных белков позволила разработать эффективный метод наработки коротких пептидов для анализа их биологической активности. Как и в случае клонотек генов, библиотеки пептидов, полученные генно-инженерными методами, представляют собой большой (часто исчерпывающий) набор коротких пептидов. Два недавно сделанных наблюдения позволяют рассматривать библиотеку пептидов одновременно и в качестве библиотеки эпитопов белков. Во-первых, короткие пептиды могут включать все основные остатки аминокислот, играющие главную роль во взаимодействии с антителами, и они в состоянии имитировать крупные антигенные детерминанты белков. Во-вторых, в большинстве случаев нековалентные связи, образуемые между немногими наиболее важными остатками аминокислот белковых лигандов и их рецепторами, вносят основной вклад в общую энергию взаимодействия лиганд-рецептор. С учетом этого любой пептид можно рассматривать как потенциальный лиганд, гаптен или часть антигенной детерминанты более крупных полипептидов, а любую библиотеку пептидов - как библиотеку эпитопов белков или потенциальных лигандов для соответствующих белковых рецепторов.
Библиотека пептидов, полученная в результате реализации третьего подхода, в современном виде представляет собой набор десятков или даже сотен миллионов коротких различающихся последовательностей аминокислот, которые экспрессированы на поверхности вирионов бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Это становится возможным благодаря введению методами генной инженерии в геном бактериофагов гибридных рекомбинантных генов, кодирующих измененные структурные белки его вирионов. (Данный метод известен под названием фагового дисплея.) В результате экспрессии таких генов образуются гибридные белки, на N- или С-концах которых присутствуют дополнительные последовательности аминокислот.
Библиотеки пептидов и эпитопов найдут свое применение и в исследованиях механизмов гуморального иммунного ответа, а также заболеваний иммунной системы. В частности, большинство аутоиммунных заболеваний сопровождается образованием аутоантител против антигенов собственного организма. Эти антитела во многих случаях служат специфическими маркерами того или иного аутоиммунного заболевания. С использованием библиотеки эпитопов, в принципе, можно получить пептидные маркеры, с помощью которых было бы возможно следить за специфичностью аутоантител во время развития патологического процесса как в индивидуальном организме, так и в группе пациентов и, кроме того, определять специфичность аутоантител при заболеваниях неизвестной этиологии.
Библиотеки пептидов и эпитопов потенциально могут быть использованы также
для скрининга иммунных сывороток с целью выявления пептидов, специфически
взаимодействующих с защитными антителами. Такие пептиды будут имитировать
антигенные детерминанты патогенных организмов и служить мишенями для защитных
антител организма. Это позволит использовать подобные пептиды для вакцинации
пациентов, у которых отсутствуют антитела против соответствующих патогенов.
Изучение эпитопов с помощью библиотек пептидов является частным случаем одного
из многочисленных направлений их использования в прикладных и фундаментальных
исследованиях взаимодействия лигандов и рецепторов. Дальнейшее
усовершенствование этого подхода должно способствовать созданию новых
лекарственных препаратов на основе коротких пептидов и быть полезным в
фундаментальных исследованиях механизмов белок-белковых взаимодействий .
3.2 Белки-репортеры в гибридных белках
В другом случае гибридные белки применяют для получения высокого уровня экспрессии коротких пептидов в бактериальных клетках благодаря стабилизации этих пептидов в составе гибридных белков. Часто гибридные белки используют для идентификации и очистки трудноопределяемых рекомбинантных белков. Например, присоединив к С-концу исследуемого белка в качестве белка-репортера галактозидазу, можно производить очистку рекомбинантного белка по активности галактозидазы, определяя ее антигенные детерминанты иммунохимическими методами. Соединяя фрагменты ДНК, содержащие открытые рамки считывания (ОРС), с генами белков-репортеров, можно очистить такие гибридные белки по активности белка-репортера и использовать их для иммунизации лабораторных животных. Полученные антитела далее применяют для очистки нативного белка, в состав которого входит рекомбинантный полипептид, кодируемый ОРС, и тем самым идентифицируют клонированный фрагмент гена .
С помощью гибридных белков решают и обратную задачу клонирования
неизвестного гена, к белковому продукту которого имеются антитела. В таком
случае конструируют клонотеку последовательностей нуклеотидов, представляющих
ОРС неизвестных генов, в векторах, которые позволяют соединять клонируемую ОРС
в одной рамке считывания с геном-репортером. Образующиеся в результате
экспрессии этих рекомбинантных генов гибридные белки идентифицируются с помощью
антител иммуноферментными методами. Гибридные гены, объединяющие секретируемые
белки и белки-репортеры, дают возможность по-новому исследовать механизмы
секреции, а также локализацию и перемещение в тканях секретируемых белков .
3.3 Некоторые достижения белковой инженерии
Заменив несколько аминокислотных остатков лизоцима бактериофага Т4 на цистеин получен фермент с большим числом дисульфидных связей, благодаря чему этот фермент сохранил свою активность при более высокой температуре.
Замена остатка цистеина на остаток серина в молекуле р-интерферона человека, синтезируемого кишечной палочкой, предотвращала образование межмолекулярных комплексов, при котором примерно в 10 раз уменьшалась противовирусная активность этого лекарственного средства.
Замена остатка треонина на остаток пролина в молекуле фермента тирозил-тРНК-синтетазы повысило каталитическую активность этого фермента в десятки раз: он стал быстрее присоединять тирозин к тРНК, переносящей эту аминокислоту в рибосому в ходе трансляции.
Субтилизины - богатые серином ферменты, расщепляющие белки. Они секретируются многими бактериями и широко используются человеком для биодеградации. Они прочно связывают атомы кальция, повышающие их стабильность. Однако в промышленных процессах присутствуют химические соединения, которые связывают кальций, после чего субтилизины теряют свою активность. Изменив ген, ученые удалили из фермента аминокислоты, участвующие в связывании кальция, и заменили одну аминокислоту на другую с целью повышения стабильности субтилизина. Измененный фермент оказался стабильным и функционально активным в условиях, близких к промышленным.
Была показана возможность создания фермента, функционирующего по типу рестриктаз, расщепляющих ДНК в строго определенных местах. Ученые создали гибридный белок, один фрагмент которого узнавал определенную последовательность нуклеотидных остатков в молекуле ДНК, а другой расщеплял ДНК в этом участке.
Активатор тканевого плазминогена - фермент, который используют в клинике для растворения сгустков крови. К сожалению, он быстро выводится из системы кровообращения и его приходится вводить повторно или в больших дозах, что приводит к побочным эффектам. Внеся три направленные мутации в ген этого фермента, получили долгоживущий фермент, обладающий повышенным сродством к разрушаемому фибрину и с такой же фибринолитической активностью, как у исходного фермента.
Произведя замену одной аминокислоты в молекуле инсулина, ученые добились того, что при подкожном введении этого гормона больным, страдающим диабетом, изменение концентрации этого гормона в крови было близко к физиологическому, возникающему после приема пищи.
Существует три класса интерферонов, обладающих противовирусной и противораковой активностью, но проявляющих разную специфичность. Заманчиво было создать гибридный интерферон, обладающий свойствами интерферонов трех типов. Были созданы гибридные гены, включающие в себя фрагменты природных генов интерферонов нескольких типов. Часть этих генов, будучи встроенными в бактериальные клетки, обеспечивали синтез гибридных интерферонов с большей, чем у родительских молекул, противораковой активностью.
Природный гормон роста человека связывается не только с рецептором этого гормона, но и с рецептором другого гормона - пролактина. Для того, чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе лечения, ученые решили устранить возможность присоединения гормона роста к пролактиновому рецептору. Они добились этого, заменив некоторые аминокислоты в первичной структуре гормона роста с помощью генетической инженерии.
Разрабатывая средства против ВИЧ-инфекции, ученые получили гибридный белок, один фрагмент которого обеспечивал специфическое связывание этого белка только с пораженными вирусом лимфоцитами, другой фрагмент осуществлял проникновение гибридного белка внутрь пораженной клетки, а еще один фрагмент нарушал синтез белка в пораженной клетке, что приводило к ее гибели.
Белки являются основной мишенью для лекарственных средств. Сейчас
известно около 500 мишеней для действия лекарств. В ближайшие годы их число
возрастет до 10 000, что позволит создать новые, более эффективные и безопасные
лекарства. В последнее время разрабатываются принципиально новые подходы поиска
лекарственных средств: в качестве мишеней рассматриваются не одиночные белки, а
их комплексы, белок -белковые взаимодействия и фолдинг белков .
Заключение
Технология белковой инженерии используется (часто - в сочетании с методом рекомбинантных ДНК) для улучшения свойств существующих белков (ферментов, антител, клеточных рецепторов) и создания новых, не существующих в природе протеинов. Такие белки применяются для создания лекарственных препаратов, при обработке пищевых продуктов и в промышленном производстве.
В настоящее время наиболее популярной областью применения белковой инженерии является изменение каталитических свойств ферментов для разработки «экологически дружественных» промышленных процессов. С точки зрения охраны окружающей среды ферменты являются наиболее приемлемыми из всех катализаторов, используемых в промышленности. Это обеспечивается способностью биокатализаторов растворяться в воде и полноценно функционировать в среде с нейтральным рН и при сравнительно низких температурах. Кроме того, благодаря их высокой специфичности, в результате применения биокатализаторов образуется совсем немного нежелательных побочных продуктов производства. Экологически чистые и энергосберегающие промышленные процессы, использующие биокатализаторы, уже давно активно внедряются химической, текстильной, фармацевтической, целлюлозно-бумажной, пищевой, энергетической и других областях современной промышленности.
Однако некоторые характеристики биокатализаторов делают их использование в ряде случаев неприемлемым. Например, большинство ферментов распадается при повышении температуры. Ученые пытаются преодолеть подобные препятствия и увеличить стабильность ферментов в суровых условиях производства с помощью методов белковой инженерии.
Кроме промышленного применения, белковая инженерия нашла себе достойное место и в медицинских разработках. Исследователи синтезируют белки, способные связываться с вирусами и мутантными генами, вызывающими опухоли, и обезвреживать их; создают высокоэффективные вакцины и изучают белки-рецепторы клеточной поверхности, которые часто являются мишенями для фармацевтических препаратов. Ученые, занимающиеся усовершенствованием продуктов питания, используют белковую инженерию для улучшения качеств белков, обеспечивающих сохранность продуктов растительного происхождения, а также желирующих веществ или загустителей.
Еще одной областью применения белковой инженерии является создание белков, способных нейтрализовать вещества и микроорганизмы, которые могут быть использованы для химических и биологических атак. Например, ферменты гидролазы способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в сельском хозяйстве пестициды. При этом производство, хранение и использование ферментов не опасно для окружающей среды и здоровья людей .
белок инженерия мутагенез модифицированный
Список литературы
1. Белковая инженерия.
2. Белковая инженерия. Загадки генетики. /Вячеслав Маркин // Тайны, загадки, факты.
Белковая инженерия. // Большая Российская энциклопедия.
Белковая инженерия. // Справочник химика 21.
Белковая инженерия и эффективность лекарств.
Белковая инженерия. / А.И. Корнелюк // Biopolymers and Cell.
Белковая инженерия повысит эффективность лекарств. // Популярная механика.
Белковая инженерия. Получение инсулина. // Биофайл - научно-информационный журнал.
Биотехнология. Основные направления и достижения. // Биология для абитуриентов и учителей.
Богданов А.А., Медников Б.М. Власть над геном / А. А. Богданов, Б.М. Медников - М.: Просвещение, 1989 - с.208
Генная инженерия. // Здравие.
Гены и химики. // Генетика.
13. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. - М.: Мир, 2002.
14. Другие области применения генной инженерии. / Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик // Медицина - новости и технологии.
15. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухин Е.А. Основы биотехнологии. / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухин - М., 2003.
16. Инженерия белка. // Химия и биотехнология.
17. Патрушев Л.И. Экспрессия генов/ Л.И. Патрушев - М.: Наука, 2000. - 496с.
Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Т. 1: Генная и белковая инженерия. /Л.И. Патрушев - М.: Наука, 2004. - 526 с.
Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии: Учебник для вузов/В.Н. Рыбчин - СПб.: Изд-во СПбГТУ, 2002. - 522 с.
Степанов В.М. Молекулярная биология. Структуры и функции белков. / В.М. Степанов - М.: Высшая Школа, 1996.
Технологии биотехнологии: белковая инженерия, нанобиотехнология, биосенсоры и биочипы. / Евгения Рябцева // «Коммерческая биотехнология» - интернет-журнал.
Чернавский Д.С., Чернавская Н.М. Белок-машина. Биологические макромолекулярные конструкции. / Д.С. Чернавский, Н. М. Чернавская - М.: Изд-во МГУ, 1999.
Шульц Г.Е., Ширмер Р.Х. Принципы структурной организации белков. / Г.Е. Шульц, Р.Х. Ширмер - М.: Мир, 1982.
24. Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12;
25. Protein engineering. // Wikipedia, the free encyclopedia.
Технология белковой инженерии используется (часто - в сочетании с методом рекомбинантных ДНК) для улучшения свойств существующих белков (ферментов, антител, клеточных рецепторов) и создания новых, не существующих в природе протеинов. Такие белки применяются для создания лекарственных препаратов, при обработке пищевых продуктов и в промышленном производстве .
В настоящее время наиболее популярной областью применения белковой инженерии является изменение каталитических свойств ферментов для разработки «экологически дружественных» промышленных процессов. С точки зрения охраны окружающей среды ферменты являются наиболее приемлемыми из всех катализаторов, используемых в промышленности. Это обеспечивается способностью биокатализаторов растворяться в воде и полноценно функционировать в среде с нейтральным рН и при сравнительно низких температурах. Кроме того, благодаря их высокой специфичности, в результате применения биокатализаторов образуется совсем немного нежелательных побочных продуктов производства. Экологически чистые и энергосберегающие промышленные процессы, использующие биокатализаторы, уже давно активно внедряются химической, текстильной, фармацевтической, целлюлозно-бумажной, пищевой, энергетической и других областях современной промышленности.
Однако некоторые характеристики биокатализаторов делают их использование в ряде случаев неприемлемым. Например, большинство ферментов распадается при повышении температуры. Ученые пытаются преодолеть подобные препятствия и увеличить стабильность ферментов в суровых условиях производства с помощью методов белковой инженерии .
Кроме промышленного применения, белковая инженерия нашла себе достойное место и в медицинских разработках. Исследователи синтезируют белки, способные связываться с вирусами и мутантными генами, вызывающими опухоли, и обезвреживать их; создают высокоэффективные вакцины и изучают белки-рецепторы клеточной поверхности, которые часто являются мишенями для фармацевтических препаратов. Ученые, занимающиеся усовершенствованием продуктов питания, используют белковую инженерию для улучшения качеств белков, обеспечивающих сохранность продуктов растительного происхождения, а также желирующих веществ или загустителей.
Еще одной областью применения белковой инженерии является создание белков, способных нейтрализовать вещества и микроорганизмы, которые могут быть использованы для химических и биологических атак. Например, ферменты гидролазы способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в сельском хозяйстве пестициды. При этом производство, хранение и использование ферментов не опасно для окружающей среды и здоровья людей .
Библиотеки пептидов и эпитопов
В живом организме большинство биологических процессов управляется посредством специфических белок-белковых или белково-нуклеиновых взаимодействий. К таким процессам относятся, например регуляция транскрипции генов под действием различных белковых факторов, взаимодействие белковых лигандов с рецепторами на поверхности клеток, а также специфическое связывание антигенов соответствующими антителами. Понимание молекулярных механизмов взаимодействия белковых лигандов с рецепторами имеет большое фундаментальное и прикладное значение. В частности, разработка новых лекарственных препаратов белковой природы обычно начинается с идентификации исходной последовательности аминокислот, обладающей требуемой биологической активностью (так называемая "основная" (lead) последовательность). Однако пептиды с основной последовательностью аминокислот могут обладать и нежелательными биологическими свойствами: низкой активностью, токсичностью, малой стабильностью в организме и т.п.
До появления библиотек пептидов улучшение их биологических свойств осуществляли путем последовательного синтеза большого числа аналогов и проверкой их биологической активности, что требовало больших затрат времени и средств. В последние годы появилась возможность с помощью автоматических синтезаторов создавать за короткое время тысячи различных пептидов. Разработанные методы направленного мутагенеза также позволили резко расширить число белков, получаемых одновременно и последовательно тестируемых на биологическую активность. Однако только недавно разработанные подходы к созданию библиотек пептидов привели к получению миллионов последовательностей аминокислот, требуемых для проведения эффективного скрининга с целью выявления среди них пептидов, максимально удовлетворяющих предъявляемым критериям. Такие библиотеки используются для исследования взаимодействия антител с антигенами, получения новых ингибиторов ферментов и антимикробных агентов, конструирования молекул, обладающих требуемой биологической активностью, или придания новых свойств белкам, например антителам .
По способам получения библиотеки пептидов разделяются на три группы. К первой группе можно отнести библиотеки, полученные с использованием химического синтеза пептидов, в которых индивидуальные пептиды иммобилизованы на микроносителях. При таком подходе после присоединения очередных аминокислот в индивидуальных реакционных смесях к пептидам, иммобилизованным на микроносителях, содержимое всех реакционных смесей объединяют и разделяют на новые порции, которые используют на следующей стадии присоединения новых аминокислотных остатков. После проведения ряда таких этапов оказываются синтезированными пептиды, содержащие последовательности использованных в синтезе аминокислот во всевозможных случайных сочетаниях.
Библиотеки пептидов, иммобилизованных на микроносителях, обладают существенным недостатком: они требуют при скрининге использования очищенных рецепторов, находящихся в растворимой форме. В то же время в большинстве случаев при биологических испытаниях, проводящихся для фундаментальных и фармакологических исследований, чаще всего находят применение рецепторы, ассоциированные с мембранами. По второму способу библиотеки пептидов получают с помощью твердофазного синтеза пептидов, при котором на каждой стадии химического присоединения очередной аминокислоты к растущим пептидным цепям используют эквимолярные смеси всех или некоторых аминокислот-предшественников. На конечной стадии синтеза проводят отделение пептидов от носителя, т.е. перевод их в растворимую форму. Третий подход к конструированию библиотек пептидов, к описанию которого мы сейчас переходим, стал реальным именно благодаря развитию методов генной инженерии. Он прекрасно иллюстрирует возможности таких методов и, несомненно, является крупным достижением в их применении. В этой связи рассмотрим более подробно результаты использования библиотек пептидов в исследовании эпитопов (антигенных детерминант) белков .
Генно-инженерная технология получения гибридных белков позволила разработать эффективный метод наработки коротких пептидов для анализа их биологической активности. Как и в случае клонотек генов, библиотеки пептидов, полученные генно-инженерными методами, представляют собой большой (часто исчерпывающий) набор коротких пептидов. Два недавно сделанных наблюдения позволяют рассматривать библиотеку пептидов одновременно и в качестве библиотеки эпитопов белков. Во-первых, короткие пептиды могут включать все основные остатки аминокислот, играющие главную роль во взаимодействии с антителами, и они в состоянии имитировать крупные антигенные детерминанты белков. Во-вторых, в большинстве случаев нековалентные связи, образуемые между немногими наиболее важными остатками аминокислот белковых лигандов и их рецепторами, вносят основной вклад в общую энергию взаимодействия лиганд-рецептор. С учетом этого любой пептид можно рассматривать как потенциальный лиганд, гаптен или часть антигенной детерминанты более крупных полипептидов, а любую библиотеку пептидов - как библиотеку эпитопов белков или потенциальных лигандов для соответствующих белковых рецепторов.
Библиотека пептидов, полученная в результате реализации третьего подхода, в современном виде представляет собой набор десятков или даже сотен миллионов коротких различающихся последовательностей аминокислот, которые экспрессированы на поверхности вирионов бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Это становится возможным благодаря введению методами генной инженерии в геном бактериофагов гибридных рекомбинантных генов, кодирующих измененные структурные белки его вирионов. (Данный метод известен под названием фагового дисплея.) В результате экспрессии таких генов образуются гибридные белки, на N- или С-концах которых присутствуют дополнительные последовательности аминокислот.
Библиотеки пептидов и эпитопов найдут свое применение и в исследованиях механизмов гуморального иммунного ответа, а также заболеваний иммунной системы. В частности, большинство аутоиммунных заболеваний сопровождается образованием аутоантител против антигенов собственного организма. Эти антитела во многих случаях служат специфическими маркерами того или иного аутоиммунного заболевания. С использованием библиотеки эпитопов, в принципе, можно получить пептидные маркеры, с помощью которых было бы возможно следить за специфичностью аутоантител во время развития патологического процесса как в индивидуальном организме, так и в группе пациентов и, кроме того, определять специфичность аутоантител при заболеваниях неизвестной этиологии.
Библиотеки пептидов и эпитопов потенциально могут быть использованы также для скрининга иммунных сывороток с целью выявления пептидов, специфически взаимодействующих с защитными антителами. Такие пептиды будут имитировать антигенные детерминанты патогенных организмов и служить мишенями для защитных антител организма. Это позволит использовать подобные пептиды для вакцинации пациентов, у которых отсутствуют антитела против соответствующих патогенов. Изучение эпитопов с помощью библиотек пептидов является частным случаем одного из многочисленных направлений их использования в прикладных и фундаментальных исследованиях взаимодействия лигандов и рецепторов. Дальнейшее усовершенствование этого подхода должно способствовать созданию новых лекарственных препаратов на основе коротких пептидов и быть полезным в фундаментальных исследованиях механизмов белок-белковых взаимодействий .
